小鼠恒定链短肽ii-key增强免疫应答的研究

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1、安徽农业大学硕士学位论文小鼠恒定链短肽Ii--key增强免疫应答的研究姓名：孟凡涛申请学位级别：硕士专业：预防兽医学指导教师：余为一201205摘要主要组织相容性复合体(Majorhistocompatibilitycomplex，MHC)，是由一群紧密连锁的基因群，定位于动物或人某对染色体的特定区域，呈高度多态性；其编码的分子表达于不同细胞表面，参与抗原递呈，制约细胞间相互识别及诱导免疫应答。MHC基因家族分为两个主要的亚族：即I类基因和II类基因。MHCII类分子的q、p链在内质网中与它的Y链聚合，形成九聚体。不同于

2、0【和p链的多态性，1，链为非多态性，被称为恒定链(Invariantchain，Ii)。Ii链是MHCll分子重要的伴侣蛋白分子，它在MHCll分子的正确折叠、组装、结构维持及表达蛋白和抗原呈递中起重要的作用。在后续研究中发现Ii链跨膜区与CLIP区N端相连的四个氨基酸序列(LI洲K)，与抗原表位连接后形成的嵌合体可以起到增强免疫应答的效果，同时LRMK也被称作Ii．kev。本文研究了小鼠Ii链不同片段作为免疫载体在免疫应答中的作用。首先，通过登录GenBank数据库获得小鼠Ii链序列(登录号：NM001042605)

3、，对序列分析后依据划分的胞浆区、跨膜区、CLIP区、三聚化区分段设计多对引物，同时用实验室保存的F306(新城疫病毒的NDVF蛋白的嵌合串联表位)，克隆重组含有F306的不同Ii片段的基因嵌合体，将不同片段分别插入到原核表达载体pGEX一4T-1、pET-32a。经PCR鉴定和测序结果表明各个重组质粒均成功构建。其次，诱导表达10个融合蛋白，在表达条件优化处理后进行大量表达。大量表达的细菌经反复冻融和超声裂解处理后，提取融合蛋白，用改良的KCL染色切胶法纯化目的蛋白。经sDS．PAGE电泳检测，10个重组质粒均在大肠杆菌

4、中正确表达，分子量分别为29．8KD、36．6KD、37．OKD、37．2KD、44．8KD、45．0KD、57．5KD、23．8KD、24．8KD、23．0KD，与理论预测结果一致。最后，用含有不同Ii片段载体F306抗原肽，免疫6～8周龄的雌性Balb／c小鼠，第三次免疫后经H艮球采血，分离血清检测抗体。间接ELISA法优化条件后检测不同实验组抗体。检测结果表明，携带Ii．key和CLIP区尾部DN的抗原肽抗体效价分别是单独F306抗原肽的2倍和4倍，而增加胞浆区和跨膜区后抗体效价达到了单独F306的7倍。用抗原肽F

5、306取代CLIP区Ii抗体效价仅是单独F306抗原肽的5倍。试验中所用的F306是NDVF蛋白三个抗原表位(F72、F161和F343)的串联嵌合体，分别单独检测这6组抗体，结果显示F72的抗体效价明显高于F16l、F343，说明NDVF蛋白的优势抗原表位在66．92位氨基酸。综上所述，本文成功克隆了小鼠Ii链基于Ii—key的不同功能区基因片段，并与表位基因F306组成了嵌合体；各片段分别插入到原核质粒pGEX．4T-1、pET-32a㈣嬲中，经表达后成功获得了目的基因的融合蛋白；多种蛋白经提纯后免疫Balb／c小鼠

6、，测定抗体效价，分析了小鼠Ii链多种片段作为载体在免疫应答中的作用。为新型的恒定链活性片段载体疫苗的临床应用奠定了基础。关键词：小鼠，恒定链，免疫载体，抗体检测AbstractM旬orhistocompatibilitycomplex(MHC)iscomposedofabunchofclosely—chainedgenesgroups，whichlocatesinthespecmcsitesinpeopleandanimal’schromosomes．MHCishi曲polymo叩hismanddistributedon

7、thesurfaceofdifrerentcellssuchasantigenpresentatingcells．MHCmoleculesrestrictmutualrecognitionamongcellsandguideimmuneresponse．TheMHCgenefamilyismainlydividedintotwosubtribes：ClassIgeneandClassIIgene．AggregationbetweenⅡ，pchainofMHCIImoleculesandYchaininendoplasmi

8、creticulumfonnsnonamer．Contrasttothepolymo印hismofQandpchain，丫chainisnon-poIymo叩hism，whichisnominatedasinVariantchain(Ii)．IiisveryimponantinMHCIImoleculescorrec