基于鸡恒定链功能片段通用载体免疫增强作用的研究

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1、分类号：S852.4单位代码：10364密级：学号：11720698安徽农业大学学位论文基于鸡恒定链功能片段通用载体免疫增强作用的研究Boostingimmuneresponsewiththefunctionalsegmentsofthechickeninvariantchainasauniversalvector研究生：王琛指导教师：余为一教授合作指导教师：申请学位门类级别：农学硕士专业名称：预防兽医学研究方向：兽医微生物与免疫学所在学院：动物科技学院答辩委员会主席：2013年6月1独创性声明本人声明所呈的学位论文是本人在导师指导下进

2、行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得安徽农业大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名：签字日期：年月日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解安徽农业大学有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子文件，允许论文被查阅和借阅。本人授权安徽农业大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，

3、收录到《中国学位论文全文数据库》，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文，向社会公众提供信息服务。（保密的学位论文在解密后适用本授权书）。学位论文作者签名：指导教师签名：签字日期：年月日签字日期：年月日学位论文作者毕业后去向：工作单位：电话：通信地址：邮编：2摘要恒定链（invariantchain，Ii）是MHCⅡ类分子的伴侣蛋白，在抗原递呈过程中起重要作用。因Ii呈非多态性，故命名为恒定链。研究表明，小鼠恒定链中的Ii-key可以作为免疫载体，与抗原表位连接后，能够增强免疫应答；其他功能片段也能促进这种作用。本文旨在以

4、鸡恒定链功能片段作为载体，研究跨物种增强免疫应答的可能性及其机制。根据鸡恒定链Ii的结构，即胞浆区、跨膜区、Ii-key（CLIP区N端相连的四个氨基酸序列LQRK）、CLIP和AP（CLIP区C端的两个氨基酸序列Ala-Pro），构建了与新城疫病毒抗原表位F2连接的嵌合体（Ii-F2、Cyt/TM/Ii-key/F2/AP、TM/Ii-key/F2/AP、Ii-key/F2/AP、Ii-key/F2）。用设计的引物，以实验室保存的质粒pEGFP-C1-Ii、pGEX-4T-1-F306为模板，通过PCR及重叠延伸PCR的方法，扩增目的

5、片段，分别插入pGEX-4T-1和pET-32a原核表达载体中。通过双酶切鉴定及测序结果比对，表明正确地构建了含嵌合体的重组质粒。将构建的重组质粒导入工程菌，加入1.0mmol/LIPTG诱导表达，再经SDS-PAGE凝胶电泳鉴定。优化融合蛋白的表达条件，并进行大量表达。用反复冻融和超声波破碎的方法裂解表达菌，提取融合蛋白。获得的可溶性表达融合蛋白（His-Ii-key/F2/AP、His-Ii-key/F2、His-F2）经改良的KCl染色切胶法纯化，以包涵体形式表达的蛋白（His-Ii-F2、His-Cyt/TM/Ii-key/F2

6、/AP、His-TM/Ii-key/F2/AP）经过透析复性后再纯化。分别获得分子量约为44.7kDa、32.3kDa、29.2kDa、24.4kDa、24.0kDa和23.8kDa的六组纯化蛋白，与理论结果一致。将纯化的融合蛋白抗原免疫6-8周龄的雌性昆明系小鼠，经三次强化免疫后取特异性抗血清，用ELISA法检测血清抗体效价。同对照组单纯F2抗原组比较，Ii-key/F2免疫小鼠可将抗体水平提高1.5倍，Ii-key/F2/AP组抗体水平增强了2.5倍，而Ii的胞浆区（TM/Ii-key/F2/AP）和跨膜区、胞浆区（Cyt/TM/I

7、i-key/F2/AP）免疫组及F2取代Ii的CLIP区组（Ii-F2）的抗体增强了约3倍。Westernblot分析得知，得到的均为特异性的多克隆抗体。综上，本实验通过原核表达融合蛋白并免疫小鼠，间接ELISA法测定多抗效价，表明以鸡Ii功能片段为基础构建的嵌合体在小鼠体内均具有不同程度的免疫增强作用，从而为探索在不同物种间具有免疫增强作用的通用载体提供了有价值的数据。关键词：恒定链；嵌合体；异种免疫；免疫增强IAbstractInvariantchainisthesignificantchaperoneofMHCclassIImol

8、ecules,playsanimportantroleintheprocessofantigenpresentation.Becauseofitsnon-polymorphism，thechainnamed