浅谈低分子量透明质酸增强HAV抗原诱导的小鼠体液免疫应答的研究

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1、浅谈低分子量透明质酸增强HAV抗原诱导的小鼠体液免疫应答的研究【摘要】　　目的:研究内源性危险信号分子低分子量透明质酸作为天然佐剂对HAV抗原诱导小鼠体液免疫应答的影响。方法:将ICR小鼠分成9组,分别设生理盐水对照组、HAV抗原组、HAV抗原+铝佐剂组、HAV抗原+低分子量透明质酸50μg组、HAV抗原+低分子量透明质酸100μg、HAV抗原+低分子量透明质酸200μg、HAV抗原+低分子量透明质酸300μg、HAV抗原+低分子量透明质酸500μg、HAV抗原+低分子量透明质酸1mg组,皮下免疫小鼠。分别在4、、1、16周用ELISA法检测小鼠血清抗HAVI

2、gG水平。结果:空白对照组在4、、1和16周未见抗HAVIgG产生;各实验组抗HAVIgG水平在8周时达到最高;12周和16周时各免疫组的抗HAVIgG水平逐渐下降,尤以铝佐剂组下降明显;与HAV抗原组相比,低分子量透明质酸各免疫组小鼠血清抗HAVIgG水平明显升高;与铝佐剂组相比,低分子量透明质酸免疫组明显增强特异性抗HAVIgG水平;低分子量透明质酸安全无毒,无过敏反应。结论:低分子量透明质酸能够明显增强灭活HAV抗原的体液免疫应答,具有强的免疫佐剂作用。其免疫佐剂效应优于铝佐剂。【关键词】透明质酸危险信号佐剂免疫佐剂对辅助抗原诱导机体产生持久高水平的免疫

3、应答十分重要[1],透明质酸是从动物组织提取的一种黏多糖,由D葡糖醛酸和N乙酰基D氨基葡糖双糖单位重复连接组成。透明质酸是细胞外基质的重要成分而广泛分布于细胞外基质,它是构成皮肤、玻璃体、关节滑液和软骨组织的重要成分,具有独特的理化性质和生物学功能。近年研究表明,低分子量透明质酸是免疫系统的一种重要内源性危险信号,与TLR2作用后,以依赖于MyD88、IL1R相关激酶、TNFR相关因子6、蛋白激酶Cζ、NFκB的方式进行信号传导,激活机体的天然免疫应答[2]。因此我们推测低分子量透明质酸可能具有免疫佐剂的特性。本研究中以低分子量透明质酸作为疫苗

4、佐剂,与HAV抗原混合后皮下免疫接种小鼠,观察内源性危险信号分子低分子量透明质酸对HAV抗原诱导小鼠体液免疫应答的影响,以探讨低分子量透明质酸作为疫苗佐剂的可行性。1材料和方法材料ICR健康小鼠(SPF级,雌性,～8周龄,质量18～20g),由中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所灵长类实验动物中心提供,并按实验动物中心的方法饲养。酶标仪购自美国BioRAD公司。抗HAVIgGELISA检测试剂盒购自KPL公司,酶标板购自美国eBioscienc公司。灭活HAV抗原和Al(OH)3佐剂均由本室保存。低分子量透明质酸为10000以下）购自江苏镇江东元生物

5、科技有限公司。方法低分子量透明质酸的制备用电子天平称取适量低分子量透明质酸,用蒸馏水溶解配制成浓度为μg/L。免疫动物将ICR雌性小鼠随机分成9组,分别设生理盐水空白对照组、HAV抗原200μg免疫组、HAV抗原200μg+300μg铝佐剂免疫组、HAV抗原200μg+50μg透明质酸免疫组、HAV抗原200μg+100μg透明质酸免疫组、HAV抗原200μg+200μg透明质酸免疫组、HAV抗原200μg+300μg透明质酸免疫组、HAV抗原200μg+500μg透明质酸免疫组和HAV抗原200μg+1mg透明质酸免疫组,每组6只。免疫途径为皮下免疫,共免疫

6、1次。血清抗HAVIgG水平检测分别于免疫后4、、12和16周对小鼠尾静脉采血,血样37℃放置1h后,℃过夜,分离血清,用ELISA试剂盒检测抗HAV的特异性IgG水平,具体操作方法按照试剂盒说明书。低分子量透明质酸安全性检测低分子量透明质酸的异常毒性试验:实验组选用ICR小鼠10只,雌雄各1半,每只小鼠皮下注射mg低分子量透明质酸,同时设立生理盐水对照组,连续观察d。低分子量透明质酸的刺激性试验:取ICR小鼠2只,分别在一侧后肢股四头肌注射低分子量透明质酸1mL,另一侧注射等量生理盐水。另取ICR小鼠2只,分别在一侧后肢脚掌注射低分子量透明质酸1mL,另一只

7、注射等量生理盐水。4h后处死,解剖观察局部组织变化。低分子量透明质酸的过敏试验:取ICR小鼠10只,雌雄各1半,皮下注射50μg低分子量透明质酸,周后再尾静脉注射50μg低分子量透明质酸,立即观察有无过敏反应。统计学分析采用统计软件进行单因素方差分析,并进行Levene方差齐性检验,如方差齐,则进行单因素方差分析;而方差不齐则采用KruskalWallisHTest,P2结果.1低分子量透明质酸安全性低分子量透明质酸的异常毒性试验:试验期内所有动物均未出现松毛、缩团、发抖等异常反应;进食、饮水、粪便和精神等均正常。实验结束后所有动物均健在且质量增加,说明低分

8、子量透明质酸安全无毒。低分子量透明质酸