褐飞虱精氨酸激酶基因的克隆及其rnai载体的构建和转化

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1、华中农业大学硕士学位论文褐飞虱精氨酸激酶基因的克隆及其RNAi载体的构建和转化姓名：王欣茹申请学位级别：硕士专业：农药学指导教师：李建洪201206褐飞虱精氨酸激酶基因的克隆及其RNAi载体的构建和转化摘要褐飞虱(Nilaparvatalugens(Stal))属同翅目，飞虱科，是水稻上的主要害虫。RNAi在昆虫上成功的应用于鉴定多种基因的功能。这项技术在害虫防治领域也取得了一定进展。精氨酸激酶是调节无脊椎动物能量代谢的重要酶之一。磷酸精氨酸中的高能磷酸键在精氨酸激酶的作用下被转移形成ATP。褐飞虱精氨酸激酶(ArginineKinase，AK)

2、编码区共编码357个氨基酸，全长1071bp，根据活性区域motifCPTNLGT选择了础基因包括的333bp核苷酸片段构建dsRNA片段。扩增带T7启动子的AK活性区正义链和反义链后利用invitroTranscriptionT7Kit体外合成dsRNA，利用包含该段dsRNA的人工饲料饲喂褐飞虱进行生物活性测定。初步结果表明：持续饲喂人工饲料2d后，褐飞虱在饲喂含有akdsRNA的人工饲料后，开始死亡。8d后，死亡率达到了81．5％。由于双链RNA表达抑制转化载体pdsl301能够在植物中表达双链RNA，因此构建重组表达质粒，通过农杆菌侵染水

3、稻愈伤组织的方法以获得表达褐飞虱ak-dsRNA的转基因水稻植株。电转化农杆菌EHl05菌株后，利用PCR鉴定农杆菌转化子。以磷酸潮霉素转移酶基因为筛选标记，经过潮霉素筛选后，最终得到再生苗移栽到温室培养。通过对标记基因的检测，RT-PCR检测插入片段，得到抗性植株16株，PCR阳性植株3株，阳性率为3．7％。关键字：褐飞虱，精氨酸激酶，RNAi，载体pdsl301，农杆菌AbstractThebrownplanthopper,Nilaparvata，z秽凇，isamemberoftheHemipteraorderandisthemostdeva

4、statingriceinsectpesttohavegivenrisetooutbreakinrecentyears．RNAinterference(RNAi)isatechnologicalbreakthroughthathasbeendevelopedasapowerfultoolforsmdyinggenefunctionandforthehighlytargetedcontrolofinsectpests．Theeffectofusingafeeding-basedRNAitechniquetosilencethehrgininekin

5、ase(ak)geneinNilapawamlugensWasexamined．Argininekinaseparticipatesincellularenergymetabolismininvertebrates，whichisanalogoustothecreatinekinasereaction．AsSmemberofthephosphagenhI琊efamily,itbufferscellularATPlevelsbycatalyzingthereversiblephosphoryltransferbetweenATPandarginin

6、e，leadingtotheproductionofphosphoarginineandM92+ADP．ThecompletelycodingregionofNilaparvatalugensakis1071bpandencodesaproteinof357aminoacids．AccordingtothepartofakgenesequencewhichcontainstheactivemotifCPTNLGT,thegenespecificprimersweredesignedtoamplifytheserestrandandanti-sen

7、sestrandDNAofakgene．BecausethedesignedprimersincludeT7promotor,thesensestrandandanti．semestrandDNAofakgenecouldbetranscribedtodsRNAinvitro．Then，thepurifieddsRNAofakgenewasingestedintoNilaparvatalugensbyartificialdiet．Thepreliminaryresultsshowthatsustainedfeedingtheartificiald

8、ietcontainedakdsRNAcouldkilledNilapa九，amlugensafter2daystreatment．Af