靶向htert的特异性sirna抑制前列腺癌pc-3细胞增殖机制研究

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1、AdissertationsubmittedtoZhengzhouUniversityforthedegreeofMasterMechanismoninhibitingPC-3ProstatecancercellsproliferationbyspecificsiRNAtargetinghumantelomerasereversetranscriptaseByNingWangSupervisors：YunZhang，ZhenzhongZhang，HaixiaLiDepartmentofPharmaceuticsSchoo

2、lofPharmaceuticalSciencesApril2012原创性声明⋯IIt111111111111111l}Y2102588本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本声明的法律责任由本人承担。学位论文作者：互亍日期．为12年g月扮日学位论文使用授权声明本人在导师指导下完成的论文及相关的职务作品，知识产权归属郑州大学。根据郑

3、州大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅；本人授权郑州大学可以将本学位论文的全部或部分编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或者其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。本人离校后发表、使用学位论文或与该学位论文直接相关的学术论文或成果时，第一署名单位仍然为郑州大学。保密论文在解密后应遵守此规定。学位论文作者：药隰如l≥年}月盈日摘要＼、＼＼前列腺癌就是发生于男性前列腺组织中的恶性肿瘤，是前列腺腺泡细胞异常无序生长的结果。前列腺癌的发病率具有明显

4、的地理和种族差异。在欧美等发达国家和地区，它是男性最常见的恶性肿瘤，其死亡率居各种癌症的第二位；在亚洲，其发病率低于西方国家，但近年来呈迅速上升趋势。目前运用放疗、化疗、手术等方法来治疗前列腺癌，患者的生存率有明显提高，但是这些治疗方法选择性低，靶向性差。因此，随着分子生物学的飞速发展，基因靶向治疗前列腺癌的研究越来越受到关注。端粒酶是细胞中负责端粒的延长的一种基本的核蛋白逆转录酶，而人端粒逆转录酶(hTERT)是端粒酶重要的蛋白组分，其mRNA水平与端粒酶活性又密切关联，是调节端粒酶活性的限速步骤，特异性的抑制hTER

5、T表达可以降低端粒酶的活性，从而抑制细胞的生长，直至死亡，所以hTERT可以作为基因治疗的理想靶点。在以hTERT为靶点的肿瘤基因治疗研究中，一般都是采用RNA干扰(RNAinterference，RNAi)技术来沉默hTERT基因，其中siRNA序列的设计合成是本研究的关键。本研究便是依据RNAi原理，以hTERT基因为靶点，选用hTERT高表达的前列腺癌PC．3细胞为研究对象，设计靶向hTERT基因的小干扰RNA，通过体外转染前列腺癌PC．3细胞，筛选出有效序列，观察其对细胞增殖的抑制效果，hTERTmRNA与蛋白表

6、达，以及细胞凋亡情况，并进一步探讨其机制。在本实验中首先选用的siRNA载体为脂质体载体LipofectaminrM2000，此外还选用了碳纳米管(CarbonNanotube，CNT)作为siP,．NA的载体。但由于碳纳米管的水溶性较差，本实验中，采用单壁碳纳米管SWNT，通过对其表面修饰，即与DOTAP通过正负键结合，从而提高碳纳米管的水溶性，功能化后的碳纳米管可以很好的与siRNA结合，将siRNA迅速转入PC．3细胞中，以此来抑制细胞增殖。本研究通过以上方法为前列腺癌的治疗探索了一条新的途径。研究内容如下：一靶向

7、hTERTsiRNA有效序列的筛选对根据GenBank中人hTERT基因的mRNA序列(AF015950)和设计软件I摘要设计出的靶向hTERTsiRNA在GenBank中进行BLASTⅢ分析，剔除非相关的基因同源序列，以此保证所设计序列的特异性；从hTERTeDNA区域中筛选，GC含量以50％以上最佳，设计选取出4条hTERT-siRNA，并合成出双链siRNA，以LipofcctaminTM2000介导转染前列腺癌PC．3细胞。分别采用SRB(磺酰罗丹明B)法，RT-PCR法评价其对细胞的生长，hTERTmRNA表达

8、的抑制作用，从而筛选出效果最好的序列。二RNA干扰抑制hTERT表达诱导PC．3细胞凋亡利用筛选出的有效序列深入研究其机制，在此部分，用LipofcctaminTM2000将此siRNA序列转染入前列腺癌PC．3细胞后，以PI单染法，检测它们对细胞周期的影响；以AnnexinV-FITC／PI双染法，检测它们对细胞凋