靶向survivin sirna与5fu协同抑制mcf7细胞增殖的论文

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1、靶向survivinsiRNA与5Fu协同抑制MCF7细胞增殖的论文【摘要】目的研究以survivin为靶标的小干扰rna（sirna）与化疗药5fu联合应用抑制mcf7细胞增殖的作用。方法以脂质体为载体，将survivinsirna转染至mcf7细胞中，用四氮唑盐（mtt）法染色并计算sirna联用5fu对mcf7细胞的抑制率，用sas统计软件及金正均q值法进行统计分析。结果单用5fu，ic50为4.42μg/ml；加入5nmol/lsirna后，ic50降为1.18μg/ml；si

2、rna与5fu联用的抑制作用较单用5fu强（f=26.74，p＜0.01)；q值分析表明survivinsirna与中低浓度的5fu联用，有较好的协同作用（q≥1.15）。结论survivinsirna与5fu联用，可显著增强对mcf7细胞增殖的抑制,提高肿瘤细胞对化疗药物的敏感性。【关键词】rna干扰化学疗法联合治mcf7目前化疗存在两个主要缺点,一是化疗药物对正常细胞的毒性,二是肿瘤细胞对化疗药物的耐药性。本研究通过rna干扰技术靶向抑制调节细胞凋亡的survivin基因的表达，旨在研

3、究survivinsirna诱导乳腺癌细胞mcf7凋亡和提高其对常用抗肿瘤药物敏感性的作用，探讨survivin基因用于肿瘤基因治疗的可能性。1材料与方法1.1主要试剂lipofectamim2000购自美国invitrogen公司，四氮唑盐（mts）购自美国promega公司，5氟尿嘧啶（5fu）购自天津人民制药厂（生产批号：0204242）。.cOm1.2细胞培养mcf7细胞组织来源为人乳腺癌,上皮样贴壁生长，购于北京大学医学部分子生物中心。3天左右传代一次,0.25%胰蛋白酶消化,新鲜配

4、制含10%胎牛血清的prmi1640培养基在37℃、5%co2及饱和湿度环境下培养。1.3survivinsirna的制备根据elbashir等[1]确定的sirna的特点，利用t7rna聚合酶体外转录合成sirna的方法[2]，筛选出了一条rna干扰survivin基因的靶序列。这条序列通过计算机经blast检索证明与survivin以外的人类基因无同源性。survivintargetmrna5′gtctggcgtaagatgatgg3′sirna5′gucuggcguaagaugaugguu3′

5、senestrand3′uucagaccgcauucuacuacc5′antisensestrand1.4联合用药体外抗肿瘤活性测定在96孔细胞培养板中，每孔加入含4×103个mcf7细胞的100μl培养液，置37℃、5％co2孵箱培养24h。在无血清无双抗状态下，用脂质体lipofectintm2000，按其说明书进行sirna的转染，sirna的最终浓度为5nm。转染6h后，换含不同浓度5fu的培养液100μl。化疗药物5fu取其ic50上下的5个浓度（ic50为5fu对经脂质体处理后的m

6、cf7细胞的半数致死剂量）（5fu：1.25、2.5、5、10、20μg/ml）分别与sirna相组合，每种浓度组合重复4孔，以单用sirna及单用5fu（预先经脂质体处理）作为单药对照组，以经脂质体处理后不加药组作为空白对照。继续培养48h后，每孔加20μlmts，置于37℃、5％co2孵箱90min后，用多功能酶标仪测定吸光度a490nm，并计算细胞增殖抑制率i。i%=（a对照-a测定）/（a对照-a空白）×100%1．5统计学方法采用sas统计软件进行析因分析。1．6协同作用分析方法评价联

7、合用药对肿瘤细胞的抑制是否有协同作用，参照文献[3，4]以金正均q值法判断：q=ea+b/(ea+eb-ea×eb)，其中ea+b为合并用药的抑制率，ea和eb分别为a药和b药单独用药的抑制率。式中分子代表“实测合并效应”，分母是“期望合并效应”，q是两者之比。q＜0.85为拮抗，0.85≤q＜1.15为相加，q≥1.15为协同。2结果2．1联合用药对mcf7细胞增殖的抑制图1表明，单用5fu，ic50为4.42μg/ml；加入5nmol/lsirna后，ic50降为1.18μg/ml。上述结果说

8、明在化疗药物中加入survivinsirna后，药物对mcf7的抑制效果均有明显增加，并且可以看出随着化疗药物浓度的增加，抑制率增高的趋势均逐渐变缓。2.2对化疗药物5fu与sirna联用进行析因设计的方差分析采用sas统计软件对以上数据进行分析，sirna+5fu的f值为26.74，p值均<0.01。2.3survivinsirna与化疗药物5fu之间的交互作用分析采用药理学上较为经典的方法即金正均q值法[3,4]分析两药之间的交互作用。