靶向vegf的sirn某协同5-fu抑制人乳腺癌细胞的实验分析

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1、第一章材料和方法[5]低温高速离心机(Centrifuge5804R)为Eppendorf公司产品；[6]紫外分光光度计(BioPhotometer)为Eppendorf公司产品；[7]电子分析天平为Sartorius公司产品；[8]酶联免疫检测仪、PCR扩增仪为BIO—RAD公司产品；[9]UVPGDS-8000凝胶成像系统为基因有限公司产品；[10]稳压稳流电泳仪(DYY-IIl5)为北京六一仪器厂产品；[11]微型双面垂直电泳装置为GeneTech有限公司产品；[12]79—1磁力加热搅拌器为江苏省金坛市医疗器械厂产品；

2、[13]WD一9405A型脱色摇床为北京市六一仪器厂产品。1．3人乳腺癌细胞MCF-7的培养1．3．1细胞的复苏[1]将DMEM培养液(含20％的胎牛血清，1％的双抗)置于恒温培养箱37℃预热30min，备用。[2]从液氮罐或-80oC冰箱中迅速取出MCF一7细胞冻存管，并查看冻存管上标记的记录日期，迅速置入己制备好的37oC水浴中，不断晃动，速溶(必须在卜2min内使冻存液完全融化)。[3]用75％的酒精擦拭冻存管消毒后，将融化的细胞悬液移入10m1的无菌试管中，用吸管缓慢加入4mlDMEM细胞培养液吹打均匀，离心(1000

3、g，5min)。[4]离心后弃上清液，再加入5ml培养液，吹打均匀。[5]将吹打均匀的细胞悬液转移到培养瓶中(培养瓶中的培养液总量为5—6ml左右)。[6]显微镜下观察细胞状态，培养瓶置于37oC5％C0：培养箱中培养。[7]24h后显微镜下观察细胞状态，并更换培养液继续培养。1．3．2细胞传代[1]显微镜下观察细胞生长状态，待细胞生长汇合达到75％"---85％时进行传代。[2]弃去旧培养液，加入5ml的PBS溶液，轻轻摇晃，冲洗一下细胞生长面，然后倒掉PBS溶液。[3]加入1．5m1胰酶和EDTA混合消化液，显微镜下观察消

4、化大约Imin，所有细胞基本变圆。4青岛大学硕士学位论文[4]加入3mlDMEM培养液终止消化，用一次性塑料吸管缓慢吹打成单细胞悬液。[5]将单细胞悬液吸入一干净的无菌试管中，1000g离心5min。[6]倒掉上清液，加入10ml的DMEM培养液吹打均匀，平均分配到2个培养瓶中，置于37oC5％C0：培养箱中继续培养。1．4慢病毒感染人乳腺癌细胞MCF-7条件的优化[1]选择数生长期且生长状态良好的细胞，弃去旧的培养液，加入5ml的PBS溶液，冲洗细胞生长表面，然后倒掉PBS溶液。[2]加入1．5ml胰酶和EDTA混合消化液，

5、显微镜下观察消化大约1min，所有细胞基本变圆。[3]加入3mlDMEM培养液终止消化，用一次性塑料吸管吹打均匀后吸入一干净的无菌试管中，1000g离心5min。[4]弃去上清液，加入5ml的DMEM培养液吹打成单细胞悬液，用细胞计数板进行细胞计数。[5]调整细胞密度至1X105／ml，以每孔5X104个细胞(O．5m1)接种于24孔板中，接种时以“钟表式”的方式，在孔的多处滴加单细胞悬液，以利于细胞铺板均匀。[6]将细胞培养板置于37oC5％C0。培养箱中培养24h。[7]．细胞培养24h后观察细胞生长状态，待细胞汇合度达3

6、0％-、,50％时进行转染(汇合度太高影响转染效率)。[8]准备好细胞转染所需的所有试剂及材料。[9]于-80oC冰箱中取出VEGF-siRNA-Lv阳性病毒载体及NC—Lv阴性慢病毒载体，至于冰盒上。[10]将培养板中的细胞分为3组：慢病毒RNA干扰组、慢病毒NC—Lv阴性对照组及正常对照组。[11]慢病毒RNA干扰组和慢病毒NC-Lv阴性对照组细胞分别在正常培养液(含10％胎牛血清的DMEM培养液)、正常培养液加Polybrene、增强感染液(EIS)及EIS加Polybrene四种条件下进行慢病毒感染，每种条件下设两个感

7、染复数(MOI值分别为20、40)，每个感染复数下设置3个复孔，正常对照组只更换培养液。[12]弃去24孔板中的旧培养液，每种条件下，将相应的MOI值的病毒液与相应的正常培养液、EIS和Polybrene混合均匀，加入到相应的孔中，正常对照孔更换新鲜的正常培养液。[13]将细胞培养板置于37oC5％C0。培养箱中培养。第一章材料和方法[14]于8"-'12h镜下观察细胞生长状态，与正常对照组细胞相比，若细胞生长状态变化明显(说明病毒可能对细胞有明显的毒性作用)，应及时更换新鲜培养液，若细胞生长状态变化不大，可以继续培养24h后

8、更换新鲜培养液。[15]分别于感染48h、72h、96h荧光显微镜下观察荧光蛋白的表达以确定慢病毒的感染效率。1．5MCF-7细胞分组及处理将人乳腺癌细胞MCF-7分为五组：正常对照组细胞不作任何特殊处理，阴性对照组细胞感染NC-Lv阴性病毒，慢病毒RNA干扰组细胞感染VEG