促肾上腺皮质激素释放因子(crf)对人胶质瘤细胞株u87crfr1表达的比较研究

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1、河北医科大学硕士学位论文促肾上腺皮质激素释放因子(CRF)对人胶质瘤细胞株U87CRFR1表达的比较研究姓名：冯岩申请学位级别：硕士专业：外科学指导教师：王立群201203中文摘要促肾上腺皮质激素释放因子(CIⅫ)对胶质瘤细胞株U87CRFRl表达的比较研究摘要促肾上腺皮质激素释放因子(Corticotropin．releasingfactor，CRF)是一种重要的神经内分泌肽，主要生理作用是刺激腺垂体合成和分泌促肾上腺皮质激素(Adrenocorticotropichormon，ACTH)及其有关多肽。CRF及其肽家族

2、共同调节机体在应激状态下丘脑一垂体一肾上腺(Hypothalamus．pituitary．adpenalaxis，HPA)轴的功能，并且协调应激状态下内分泌系统、自主神经系统、免疫系统、生理学及行为学等功能，并对心血管、胃肠道、生殖、皮肤等有调节作用。CRF及其相关肽通过其受体(Corticotropinreleasingfactorreceptor，CRVR)发挥作用。CRF受体属于G．蛋白偶联受体，通过腺苷酸环化酶的活化发挥作用。促肾上腺皮质激素释放激素受体l(Corticotropinreleasingfactor

3、receptor1，CRFRl)是HPA轴中最主要的受体，主要介导经典的CRF促进垂体ACTH释放的作用，参与应激反应。而在人类中枢系统的一些恶性肿瘤组织中亦发现存在有CRFRl受体的过度表达。但在CRF及其受体与胶质瘤的研究中还未曾发现它们之间存在有某些确定的理论关系。目的：探讨人胶质瘤细胞株U87中CRFRl受体表达及其应用不同浓度CRF作用U87细胞后CRFRl受体的表达情况。方法：1从培养的U87细胞中提取总RNA(ribonucleicacid)，设计CRFRl引物，进行RT-PCR扩增，凝胶电泳分析结果。2不

4、同浓度CRF作用于胶质瘤细胞U87作用。将U87传代后随机分为四组，每组分别加入不同浓度的CRF(10-7,10-910。12mol／L)和不加CRF(对照组)的DMEM(含10％牛清+青链霉素)培养基，在有盖玻片的六孔培养板中继续培养U87细胞。培养12h后，每个浓度分别各取出两个孔中的细胞，进行细胞的免疫化学染色。剩余孔中细胞继续培养，在24h后以同样的方法再取出一批进行细胞免疫组化。最后一批于48h后取出行细胞免疫组化。实验重复三次。最后以细胞免疫组化结果中CRFRl表达的阳中文摘要性率为结果进行统计学分析。结果：

5、1RT-PCR的结果显示人胶质瘤U87中存在CRFRlmRNA表达。2．进行免疫细胞化学染色，结果显示所有组中均表达CRFRl阳性，阳性反应物位于胞浆，在细胞核周边呈现清晰淡黄色或棕黄色。以CRFRl表达的阳性率为统计数据：2．1采用单因素方差分析不同CRF浓度对CRFRl表达的影响，每个实验组和对照组相比较，经统计学处理结果如下：12h(F=8．099，P<0．05)：24h(F=51．665，P<0．05)：48h(F=14．531，P<0．05)。可以认为不同CRF浓度对U87作用对CRFRl阳性表达率存在影响。在

6、作用12或48h，CRFl0‘9mol／L和其它各浓度组比较均有差别，而其它各浓度组间比较均无差别。在作用24小时，对照组和CRFl0。9mol／L比较有差别；对照组和CRF10～mol／L，CRF10J2mol／L比较无差别；CRF10‘7mol／L和CRF10。12mol／L组比较有差别。2．2采用单因素方差分析分析不同作用时间对CRFRl表达阳性率的影响，经统计学处理结果如下：CRFl0‘7mol／L作用不同的时间对CRFRl表达阳性率无影响(F=1．839，P=0．238)；CRFl0‘12mol／L作用不同的时

7、间对CRFRl表达阳性率无影响(F=3．884，P=0．083)；CRFl0母mol／L作用不同的时间对CRFRl表达阳性率有影响(F=90．66，P=0．0001)，不同时间的多重比较中任意两组比较均有差别。2．3对不同浓度CRF及其在不同的时间点相互交叉作用U87后CRFRl表达的阳性率数据进行析因分析；CRF不同的浓度对其CRFRl表达率有影响(F=21．185，P=0．0001)；不同的作用时间点对CRFRl表达率也有影响(F=27．954，P=0．0001)：并且不同的CRF浓度和不同的作用时间存在有交互作用(

8、F=27．458，P=0．0001)；不同CRF药物浓度及不同的时间，CRFRl表达阳性细胞百分率有所差异，在31％"--93％之间。并且表达强度亦有差别。在CRFl0国mol／L且24小时，结果显示为CRFRl表达阳性最强，呈棕褐色，并且表达阳性率最高，平均在87％左右。在CRFl0母mol／L作用48小时，CRF