同种异体nk细胞对人脐静脉内皮细胞的杀伤活性差异及分子机制探讨论文

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1、南方医科大学硕士学位论文同种异体NK细胞对人脐静脉内皮细胞的杀伤活性差异及分子机制探讨姓名：何颖芝申请学位级别：硕士专业：内科学（血液病学）指导教师：郭坤元20080410硕士学位论文同种异体NK细胞对人脐静脉内皮细胞的杀伤活性差异及分子机制探讨硕士研究生：何颖芝指导教师：郭坤元教授摘要背景与目的NK细胞是淋巴细胞中的一类特殊杀伤细胞，其杀伤活性的启动既不需抗原刺激，亦不需抗体参与，具有排斥异己细胞的作用。NK细胞对靶细胞的杀伤作用，受其表面的激活性受体和抑制性受体之间平衡的调节。其中NKG2D传导活化信号，配体包括MICA／MICB，ULBPl．3分子；

2、KIR传导抑制信号，其配体为HLA．I类分子。移植的组织器官是否表达异体NK细胞KIR不能识别的HLA分子，会影响NK细胞对组织细胞的杀伤活性。同种异体NK细胞对靶细胞杀伤与骨髓移植中的肝静脉血管闭塞病(veno．occlusivediseaseoftheliverVOD)及器官移植排斥反应有关系。血管内皮细胞是供受体循环细胞之间的第一道屏障。循环的宿主淋巴细胞可直接识别异种血管内皮细胞而发动免疫攻击，或与移植物抗原及血管内皮上的抗原递呈细胞相互作用，损伤内皮细胞，从而使移植物血液循环障碍，最终导致移植物被排斥，移植失败。本研究以人脐静脉内皮细胞系做为靶细

3、胞，探讨同种异体NK细胞对内皮细胞是否有杀伤作用，如果有杀伤，再进一步研究参与杀伤的活化性及抑制性信号系统的分子机制。中文摘要方法第一章检测ECV304细胞HLA．A、B、Cw分型及NKG2D配体MICA／B、ULBPI-3在基因水平的表达以QIAampDNA抽提试剂提取ECV304细胞的DNA：ECV304细胞HLA分型采用序列特异性引物扩增法(sequencespecificprimerpolymerasechainreproduction，PCR．SSP)，RT-PCR检测ECV304细胞NKG2D的配体MICA、MICB、ULBPl、ULBP2、U

4、LBP3的表达情况。第二章检测不同个体NK细胞KIR2DLl的表达及ECV304细胞、K562细胞NKG2D配体MICA／B、ULBPI．3表达率、HLA．I类分子表达率通过PCR．SSP法及流式细胞仪分别检测8例健康者基因及外周血细胞表面KIR2DLl类分子的表达，用流式细胞仪检测ECV304细胞NKG2D的配体MICA、MICB、ULBPl、ULBP2、ULBP3及HLA．I类分子的表达情况。用流式细胞仪检测半数抑制浓度(50％inhibitoryconcentration,IC50)浓度的环孢素A(cyclosporinA，CSA)]及2ug／ml毒

5、素(Lipopolysaccharide，LPS)作用24d,时后的ECV304细胞NKG2D配体的表达率是否有变化。第三章分离外周血NK细胞、LDH释放法测定NK细胞在效靶比20：1时对ECV304细胞的杀伤活性及anti．1(II也DLlmAb对NK细胞杀伤活性的影响免疫磁珠法分离纯化8例健康者的NK细胞。自8例健康供者分离外周血NK细胞，流式细胞仪检测KIR2DLl的表达率，LDH释放法测定NK细胞在效靶比20：1时对ECV304细胞、K562细胞的杀伤活性及anti．KIR2DLlmAb对NK细胞杀伤活性的影响。结果第一章检测ECV304细胞HLA

6、．A、B、Cw分型及NKG2D配体MICAfB、ULBPI-3在基因水平的表达1．ECV304细胞HLA基因型：PCR．SSP法检测ECV304细胞HLA．A，B，Cw基因型为A1，．；B18，一；Cw5，．。n硕士学位论文2．RT．PCR检测ECV304细胞NKG2D配体的表达：RT-PCR检测结果显示，ECV304细胞在mRNA均表达NKG2D的配体MICA、MICB、ULBPl、ULBP2、ULBP3。第二章检测不同个体外周血细胞KIR2DLI的表达ECV304细胞、K562细胞NKG2D配体MICA／B、ULBPl03表达率、HLA．I类分子表达率

7、1．不同个体检测KIR2DLl的表达率：HLA分型表明，ECV304表达KIR2DLl的配体，而不表达KIR2DL2／3、KIR3DLl的配体。PCR．SSP法检测结果显示，8例健康者在基因水平均表达KIR2DLl，并且NK细胞表面KIR2DLl表达率有较大差异，从6．2％．46．2％不等。KIR2DL2／3、KIR3DLl与ECV304细胞表面相应的HLA--A、B类分子间存在错配现象。2．流式细胞仪检测结果表明ECV304细胞表面不表达NKG2D配体MIC舳、ULBPl．3，HLA．1分子表达率为97．5％。3．流式细胞仪检测结果显示1．63ug／ml

8、CSA及2ug／mlLPS作用24小时后的ECV304细胞表面不表