骨髓源性成体干细胞体外转化为心肌样细胞的研究

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1、独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得大连医科大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名签字日期：≯!丛年』月—抬学位论文版权使用授权书本学位论文作者及指导教师完全了解大连医科大学有关保留、使用学位论文的规定，同意大连医科大学保留并向国家有关部门或机构送交学位论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权大连医科大学

2、可以将本学位论文的全部或部分内容编人有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。论文作者签名指导教师签名签字日期：!』年—生月j妇骨髓源·}生成体千细胞体外转化为心肌样细胞的研究博士研究生指导教师：指导小组：专业名称：孔晓丹曲鹏教授吕申教授中西医结合临床摘要目的：急性心肌梗死(AMI)是危害人类健康的主要疾病之一。虽然成熟心肌细胞不是终末分化细胞，但也只有有限的分裂、增殖能力。AMI患者即使有幸渡过急性期，但可由于心肌梗死(MI)后梗死部位瘢痕形成及残留心肌代偿性肥厚，引起心室重构，进而促进心力衰竭发生，最终造成患者死亡。现今用于AMI治

3、疗的方法通常为溶栓治疗、经皮冠状动脉成形术(PTCA)、冠状动脉旁路移植术(CABG)及心脏移植术等。前3项方法可改善心肌供血，但不能使坏死心肌复生，而心脏移植虽可替代受损心脏，但难以广泛的推广应用。近年来，随着分子生物学的发展，利用成体干细胞种植方法来增加梗死部位心肌细胞的数量，从而改善心功能及降低AMI后远期病死率，为AMI的治疗开辟了新的前景。目前，用于心脏疾病方面的成体干细胞来源主要有骨髓干细胞、骨骼肌卫星细胞、平滑肌干细胞、胚胎干细胞以及胎儿心肌细胞。骨髓干细胞在人体广泛分布而且容易获取，种植中无免疫排斥反应，也不存在伦理学的争论，因此它们在细胞性心肌整复的

4、临床应用中很有优势。本研究探讨骨髓源性的成体干细胞体外在5．氮胞苷、中药三七皂甙的诱导下转化为心肌样细胞的可行性，并将骨髓干细胞与心肌细胞共培养，探讨“心肌样”微环境对这一转化过程的影响。方法：一骨髓问充质干细胞(marrowmesenchymalstemcells，Mscs)体外诱导分化为心肌样细胞1．体外分离、培养SD大鼠MSCs。2．分别用不同浓度的5．氮胞苷(5一azacytidine，5．aza)对Mscs定向诱导，观察细胞形态学变化；在培养3周时，用免疫细胞化学染色的方法检测细胞中的心肌特异性肌钙蛋白T(cTnT)：用R1二PcR对心肌肌球蛋白重链(B．M

5、HC)进行鉴定：及电镜下观察细胞内部结构。取SD大鼠心肌细胞作为阳性对照，未经5．氮胞昔诱导正常培养的Mscs作为阴性对照。3．体外，分别将Mscs经5一氮胞苷诱导后与心肌细胞(cardiomYocvte，cM)共培养：Mscs经5．氮胞苷诱导后与破碎心肌细胞共培养；Mscs直接与心肌细胞共培养；Mscs直接与破碎心肌细胞共培养。在倒置显微镜下观察细胞形念学变化，并将培养细胞进行双标免疫细胞化学检测。4中药三七皂甙定向诱导Mscs分化为心肌样细胞。倒置显微镜下观察细胞形态；免疫细胞化学法鉴定cTnT：用RT-PCR对心肌肌球蛋白重链(B．MHC)进行鉴定。取培养的SD

6、大鼠心肌细胞作为阳性对照，未经三七皂甙诱导J下常培养的MSCs作为阴性对照。二．cD34+造血干细胞“心肌样”微环境中分化为心肌样细胞1．在体外分离、培养CD34+造血于细胞。2．将CD34+造血干细胞与分离出的新生乳鼠心肌细胞共培养。将新生乳鼠心肌细胞的培养环境模拟为在体心肌细胞的生活环境即心肌样微环境。在倒置显微镜下观察CD34+造血干细胞形态学变化。结果：一．MSCs体外诱导分化为心肌样细胞1．Mscs经5．氮胞苷诱导后1周丌始出现细胞体积及核增大，部分细胞变成长杆状、树叉状，12d后呈现较为一致的极性排列。3周后免疫细胞化学检测细胞中的cTIlT呈阳性，R丁-

7、PCR方法显示能表达B-MHC，电镜下可见细胞内肌丝形成。10岬ol／L5．氮胞苷组及20pmol／L5．氮胞苷组表达较高，但20¨mol／L5一氮胞苷组细胞较多死亡。2．MSCs经5．氮胞苷诱导后与心肌细胞共培养时，MSCs向心肌样细胞转化最快、最明显；MScs经5一氮胞苷诱导与MSCs未经诱导直接与心肌细胞共培养向心肌样细胞转化的能力基本一致；而Mscs与破碎心肌细胞共培养未向心肌样细胞转化。3．Mscs经三七皂甙诱导后2h后，大部分Mscs可分化为心肌样细胞，免疫细胞化学检测细胞中的cTnT呈阳性，R1：PcR显示能表达D—MHc，电镜下可见细