巨噬细胞激活剂polytuftsin在毕赤酵母中的表达与其活性检测

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1、中国协和医学大学中国医学科学院硕士研究生学位论文中文摘要巨噬细胞激活剂Polytuftsin在毕赤酵母中的表达及其活性检测目的：构建可持续分泌表达巨噬细胞激活剂Polytuftsin蛋白的重组毕赤酵母菌株，鉴定所获得的Polyttuftsin纯化重组蛋白的生物学活性。方法：合成串联编码40个Tuftsin单体以及6His纯化标签的载体质粒pPIC9K-6His-Polytuftsin；PEGl000化学法将线性化后的载体质粒转化入毕赤酵母菌GSll5中，筛选鉴定获得高拷贝阳性转化子；甲醇培养基诱导其分泌表达Polytuftsin蛋白，亲和纯化蛋白粗品后鉴定最终得到的纯化蛋白；体内

2、、外水平上分别检测纯化后的Polytuftsin重组蛋白的生物学功能。结果：1)成功构建了可持续分泌表达Polytuftsin蛋白的重组毕赤酵母菌株，并证实经亲和纯化后得到的Polytuftsin重组蛋白是正确的目的产物，分子量约为20Kda；2)纯化后的Polytuftsin重组蛋白能够提高鼠源巨噬细胞分泌NO、TNF-Q因子的能力，较对照组相比，提高比率可达至U43％；与此同时，还可提高人源巨噬细胞分泌No因子能力，较对照组相比，提高比率可达到56％；3)纯化后的Polytuftsin重组蛋白能够提高小鼠腹腔巨噬细胞的杀瘤能力，杀伤率可达N50％；利用Polytuftsin纯

3、化蛋白刺激后的人源巨噬细胞对人胰腺癌细胞系JF305的杀伤活力最大，可达31％；4)体内小鼠L1210白血病模型治疗实验结果发现：较对照组相比，给予Polytuftsin重组蛋白后的小鼠出腹水时间延迟，且小鼠生存期延长，平均达到21天。结论：经毕赤酵母表达系统获得的Polytuftsin重组蛋白，可以有效激活巨噬细胞，是一种新型的巨噬细胞蛋白激活剂。关键词：Polytuftsin毕赤酵母巨噬细胞北京协和医学院中国医学科学院硕士研究生学位论文英文摘要RecombinantmacrophageactivatorPolytuftsinexpressedi‘nPichiapastoris

4、anditsbiologicalacti、，j时analysisObjective：ToexpressaproteinnamedPolytuflsin，whichisamacrophageactivator,inPichiapastorisandtoidentifyitsbiologicalactivitybothinvivoandinvitrolevel．Methods：TherecombinationplasmidencodingPolytuflsinand6Hispurledtagwassynthesized；Therecombinationplasmidwaslineda

5、ndtransformedintoPichiaPastorisGS1l5byPEG1000method；Positiveintegratedcloneswerescreenedandwereexpressedundertheinductionofmethanol；ItWasobservedthattheinfluenceofPolytufisinonmacrophageinvivoandinvitrolevel．Results：1)nePolytuftsinPichiayeastwasconstructedsuccessfully．ItWasverifiedthatthepuri

6、edrecombinantproteinisourtargetproduct，whichisabout20Kda．2)Therecombinantprotein，Polytuflsin，canactivateroutinemacrophagetosecretNo、TNF-a，therisingratewasupto43％．Beisides，therecombinantprotein，PolymRsin，canalsoactivatehumanmacrophagetosecretNO．Comparedwithcontrolgroup，therisingratewasupto56％；

7、3)1f11erecombinantprotein，Polytuflsin，wasabletoraisetheeytotoxictyofmurinemacrophagestokillL1210leukemiacells，thehighesteytotoxictyWasupto50％．弧ehumanpancreaticcancertumorcelllineJF305wasmostsensitivetohumanmacrophageactivatedbyPolytuflsin，the