人jnk3真核表达载体的构建与稳定表达shsy5y细胞系的建立

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1、重庆医科大学博士研究生学位论文人JNK3真核表达载体的构建及稳定表达SHSY5Y细胞系的建立摘要凋亡是由基因调控的细胞自主性、程序性死亡。在机体的生命活动中，细胞凋亡和抗凋亡呈现出统一的动态平衡，其间各种信号转导途径和信号分子之间存在着复杂关系，调控着细胞的生存和死亡。研究表明，细胞的凋亡和抗凋亡失衡与肿瘤的发生发展有关。c．Jun氨基末端激酶(c．JunN．terminalkinases，JNKs)为丝裂原活化蛋白激酶(mitogenactivatedproteinkinases，MAPKs)超家族成员之一。

2、现己证明MAPK通路可转导并调控细胞凋亡信号，而JNK信号通路则在其中起着十分重要的作用。在脊椎动物，JNK由jnkl、jnk2、jnk3三种基因编码，表达的JNKl、JNK2、JNK3蛋自主要位于细胞质，为丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶。这3种基因编码的蛋白产物可通过选择性剪接产生了10种转录本。JNKl和JNK2在全身各组织广泛表达，JNK3仅在脑、心脏、睾丸等组织特异表达。和JNKl、JNK2不同，只有JNK3具有一个含38个氨基酸残基的延长的N末端特殊区域。现有研究发现，JNK3与神经退行性病变、神经细胞的增殖

3、和凋亡有密切联系，可促进缺血、缺氧和有毒化学物质导致的神经细胞凋亡。但目前国内外对JNK3与肿瘤之间关系的研究本课题受田家自然科学基金资助(No．30671008)4重庆医科大学博士研究生学位论文尚不明确。因此，本课题应用DNA重组技术构建人JNK3真核表达载体，再稳定转染人神经母细胞瘤(SHSY5Y)细胞，分析其JNK3的表达，并探讨JN3与肿瘤细胞凋亡的联系，为深入研究JNK3的功能奠定基础。研究内容主要包括以下两个部分：一、YNK3真核表达载体的构建及鉴定。方法：以pDBLeu—JNK3为模板，PCR扩增

4、获得人JNK3基因全长，目的片段定向插入至真核表达载体pEGFP—C3中，并转化大肠杆菌，经抗生素平板筛选获得阳性克隆，再分别进行PCR、酶切及测序鉴定。结果：获得了长为1269bp的人JNK3编码区全长DNA片段，并成功地将其定向插入到真核表达载体pEGFP．C3的CMV启动子下游，构建成为包含人JNK3基因的重组质粒pEGFP．C3．K3，PCR和酶切鉴定证实该重组质粒带有JNK3目的基因片段，DNA测序确认插入片段的序列准确无误。结论：真核表达载体pEGFP．C3．JNK3构建成功。二、稳定表达人JNK3

5、的SHSY5Y细胞系的建立及其在细胞凋亡方面的研究。方法：通过脂质体LipofectamineTM2000将重组质粒转染SHSY5Y细胞，经G418筛选，建立稳定转染人JNK3的SHSY5Y细胞系。荧光显微镜下观察重组绿色荧光蛋白的表达，并采用RT-PCR、Westernblot检测JNK3的表达。以过氧化氢(H202)为促凋亡因素，MMT和流式细胞仪检测各细胞系的细胞增殖及凋亡情况。结果：经脂质体转染和G418抗性筛选6～8周，建立了稳定转染pEGFP．C3一JNK3质粒的SHSY5Y细胞系。在该细胞系中JN

6、K3基因能被有效地转录和翻译，且在H202诱导下，JNK3可明显抑制细胞增殖及促进细胞凋亡。5重庆医科大学博士研究生学位论文结论：稳定表达人JNK3的SHSY5Y细胞系建立成功。在H202诱导下，JNK3可明显抑制细胞增殖及促进细胞凋亡。该细胞系的建立为进一步研究JNK3的功能提供了重要的实验基础。关键词：c-jun氨基末端激酶3，pEGFP．C3载体，SHSY5Y细胞，细胞凋亡6重庆医科大学博士研究生学位论文ESTABLISHMENTOFEUK．ARYOTICEXPRESSIONVECToRPEGFP．C3．

7、J咐K3ANDSHSY5YCELLLINESTABLYEXPRESSINGJNK3ABSTRACTApoptosisisthecellularautonomouslyandorderlydeathregulatingbygene．Intheactivityoforganism，apoptosisandanti—apoptosispresenttheunifieddynamicequilibrium．Betweensignaltransductionpathwaysandsignalmolecules，there

8、mayexistcomplicatedrelationshiptoregulatethelivinganddeathofcells．Manyresearchindicatedthatdisequilibriumbetweenapoptosisandanti—apoptosismayrelatetooccurrenceanddevelopmentoftumor．Thec-JunN—ter