p53rna干扰系统的构建及其初步功能的研究

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1、2007年浙江大学医学院硕士学位论文P53基因RNA干扰系统的构建及其初步功能研究浙江大学医学院临床检验诊断学2005级硕士研究生王丽导师谢鑫友中文摘要p53基因是一种非常重要的抑癌基因，人类p53基因位于17号染色体的短臂上(17p13．1)，现已发现它在细胞周期调控、抑制细胞生长、诱导肿瘤细胞凋亡等方面有重要的作用。p53基因的突变和缺失，是许多肿瘤发生的重要原因之一。p53基因不仅与肿瘤的发生有着密切关系，而且与肿瘤血管调控、肿瘤细胞对放疗和化疗的敏感性等方面有着重要联系。p53基因的这些生物学效应主要通过激活或抑制大量下游

2、基因的表达来完成，但p53与多种基因之间存在的具体调节机制尚不明确。在功能基因组研究中．需要对特定基因进行功能丧失或突变．以确定其功能或与其它基因之间的联系。RNA干扰(RNAinterference，RNAi)是近几年发展起来的一种特异的靶基因失活技术，它通过小的双链RNA(double-strandedRNA，dsRNA)高效、特异的阻断体内特定基因的表达，促使mRNA降解，诱使细胞出现缺失特定基因表型的过程。由于RNAi高度的序列专一性．可以特异地使特定基因沉默，在众多有机体中，双链RNA能触发转录后基因沉默．因而成为敲除特

3、定基因在哺乳动物细胞系中表达的有力工具。在哺乳动物中通过RNAi机制实现基因表达的抑制有多种策略，其中以构建siRNA(smallintereferenceRNA)表达载体的方法最为稳定和持久。本研究特异性针对p53基因来设计并构建能抑制此基因的RNA干扰载体，把干扰载体稳定转染入胃癌细胞SGC-7901，从基因水平和蛋白水平检测此干扰载体的抑制效率，并观察抑"审ijp53基因的表达对胃癌细胞SGC一7901的生长影响。22007年浙江大学医学院硕士学位论文方法根据文献p53siRNA序列啪，设计并化学合成2段编码短发夹RNA序列

4、的、靶向p53基因的寡核苷酸，退火，克隆到经限制性核酸内切酶酶切后的siRNA表达载体—呻SUPER-EGFPl(pSG)启动子的下游，重组构建RNAi质粒，同时设立非特异性对照，干扰载体用限制性核酸内切酶酶切和测序鉴定，构建好的干扰载体转染胃癌细胞$6C-7901，用G418筛选建立稳定细胞系，通过RT-PCR和Westernblot检测其对p53基因的抑制效果，并利用流式细胞仪检测细胞生长周期和作细胞生长曲线的方法观察抑$4p53基因的表达对胃癌细胞$6C一7901的生长影响。结果经Hindm和EcoRI双酶切电泳分析以及插入

5、基因的序列分析证实：我们设计的碱基序列成功插入到了预计位点，一个特异性针对p53基因的干扰载体pSUPER-EGFPI-p53i(pSG-p53i)构建成功。同时，我们也构建了一个非特异性干扰载体pSUPER-EGFPl-p53c(pSC,-r}53c)作为对照。分别将pSG—p53i和pSG—p53c转染入胃癌细胞SGC一7901建立稳定细胞系，用RT-PCR检测p53基因mRNA表达变化，其结果显示：转染TpSG—p53i的胃癌细胞其p53mRNA的表达水平显著低于非特异对照，经BandScanV5．O软件分析得到mRNA表达

6、的抑制率为6鹦：用Westernblot检测p53基因蛋自表达变化，其结果表明；转染了pSG—p53i的胃癌细胞其p53基因蛋白表达量显著低于非特异对照。利用流式细胞仪检测细胞生长周期，其结果为：转染TpSC,-p53i的胃癌细胞相比对照细胞其G1期细胞减少了24．2％，S期细胞增加Y81．o％，G2期细胞减少了77．996。作转染TpSG-p53i的胃癌细胞和转染了psG—p53c的胃癌细胞的细胞生长曲线图，生长曲线图显示：与对照细胞相比，转染TpSG-p53i细胞的生长曲线发生了一定程度的左移。32007年浙江大学医学院硕士学

7、位论文结论成功的构建了能抑制p53基因的siP,NA表达载体——pSCr-p53i，此siRNA表达载体能有效的降低p53基因表达mRNA和蛋白的水平，对p53基因的表达具有较强的抑制作用。pSC,-p53i可使胃癌细胞$GC-7901的生长曲线发生左移，大量细胞由Gl期进入S期，细胞的生长增殖受到了一定的促进作用。[关键词]：RN^干扰；RNAisiRNA；p53；胃癌细胞42007年浙江大学医学院硕士学位论文TheConstructionofP53RNAinterferenceSystemandtheStudyofitsFun

8、ctionDepartmentofClinicalLaboratoryCollegeofMedicine，ZhejiangUniversityPostgraduate：Supervisor：WangLiPro．XinYouXieAsaveryimp