双配体修饰壳聚糖纳米粒肝癌细胞主动靶向给药系统的研究

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1、声明Y‘995348本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外．论文中不包含、其他人已经发表或撰写过的研究成果．也不包含为获得四川大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料．与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意．。本学位论文成果是本人在四川大学读书期间在导师指导下取得的，论文成操归四川大学所有，特此声明．’申请入：批传、指导教师：弋芝吒秒气四川大学博士学位论文双配体修饰的壳聚糖纳米粒肝癌

2、细胞主动靶向给药系统的研究摘要博士研究生姚侍指导老师侯世祥教授肝癌是我国第二位恶性肿瘤，每年死亡人数约11万人，占世界肝癌死亡人数的40％。因此，在我国对肝癌药物治疗方法进行深入的研究显得更为必要。目前研究较热的肝靶向给药系统虽然提高了抗癌药物在肝脏的浓度，降低了药物对正常组织器官的毒副作用，却多数无分辨正常肝细胞与癌变的肝细胞的能力，在杀死癌细胞的同时，也杀死了正常的肝细胞，给肝脏功能造成损伤，如能制备一可靶向至肝癌细胞的给药系统，则可提高抗癌药物在肝脏癌变部位的浓度，降低药物对正常肝组织的毒副作用，

3、使药效和治疗指数进一步提高．’本课题选择中药抗癌有效成分白藜芦醇为模型药物，以壳聚糖(cS)为载体材料，制备壳聚糖纳米粒(CS艚)，并在纳米粒上连接配体生物素Biotin与抗生物素蛋白Avidin，得到双配体修饰的纳米粒A-B-CS-NP．Avidin的N末端含乙酰半乳糖氨和甘露耱残基，通过与肝脏表面半乳糖和甘露糖受体的相互作用，Avidin可介导纳米粒靶向至肝脏；Avidin与Biotin对癌细胞有特殊的亲和力，两个配体可进一步介导纳米粒到达癌细胞，有望实现对肝癌细胞的主动靶向。为使配体Biotin顺

4、利连接到CS上，采用沉淀法制备CS-NP。用单因素法优化制备工艺，制得的白藜芦醇壳聚糖纳米粒(Rcs-CS．NP)包封率为65％，载药量为13％。平均粒径为300rim，多分散系数为0．254，体外释放行为可用双指数双向动力学描述。沉淀法制备一般常用硫酸钠溶液作为沉淀剂，制得的微粒粒径多在lIm级；而本研究以氯化钠溶液作为沉淀荆，使CS的氨基保持游离，微粒的粒径达到gilt级，在制备工艺上具创新性。使用试剂Sulfo-NHS．Biotin与CS的氨基反应生成生物素化的壳聚糖Bio-CS，采用CS．NP的

5、制备工艺制得Biotin修饰的壳聚糖纳米粒B-CS·NP：在B-CS-NP溶液中，利用Avidin与Biotin之间有很强的亲和力，分别按Biotin：Avidin(2：1)及Biotin：Avidin(1：1)的比例加入Avidin溶液，得到Avldin与Biotin双配体修饰的纳米粒A．B．CS-NP及Avidin修饰的纳米粒A-CS．NP。四川大学博士学位论文选用试剂盒，以HABA染料法成功地测定了包封白藜芦醇的B-CS—NP及A-B-CS-NP表面Biotin的连接密度，以retoolsBiot

6、in，retoolsCS为单位，分别为2及1；含药B￡S．NP平均粒径为263rim，多分散系数为0．170；含药A-8￡S-NP平均粒径为319咖，多分散系数为O．155；两种纳米粒的包封率在65％左右，载药量在ll％左右；体外释放过程均符合双指数双向动力学方程。本部分研究选择简单的合成反应与结合途径，在国际上率先将分别具有肝靶向及癌细胞靶向功能的配体Avidin与Biotin连接至CS-NP上，以弥补单一配体修饰载体对特定组织的特定细胞靶向能力的不足，增强给药系统对肝脏癌细胞的特异性，并建立了相应的

7、质量评价方法，构思新颖、巧妙、严谨，具较强的创造性。在动物体内分布研究中，以白藜芦醇溶液为对照，采用HPLC法测定了各纳米制剂经小鼠尾静脉注射后，不同时间点药物的体内分布情况。含药CS．NP、B．CS-NP及A-B．CS．NP对肝脏的相对靶向效率分别为白錾芦醇对照溶液的2．29。1．66及2．54倍，表明Avidin配体的引入提高了纳米粒对肝脏的靶向性，双配体修饰的A．B．CS-NP具有明显的肝靶向作用。利用已证实的Avidin对肝脏的主动靶向性，以Biotin作中介，将Avidin连接至纳米粒上，以增

8、强纳米粒对肝脏的靶向能力，此部分研究国内外未见报道。用FITc标记纳米粒，使用酶标仪定量考察了人肝癌HepG2细胞对纳米粒的摄取情况。结果显示，细胞对单配体及双配体修饰的纳米粒的摄取量明显高于无配体修饰的纳米粒CS-NP(P