dna修复基因mgmt沉默对人脑胶质瘤化疗的影响

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1、DNA修复基因MGMT沉默对人脑胶质瘤化疗的影响中文摘要胶质瘤细胞对烷化剂类化疗药物产生抗药性是化疗失败的一个主要原因。DNA修复酶—06甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶(06．methylguanineDNAmethyltransferase，MGMT)在脑胶质瘤组织中的表达与肿瘤细胞对双氯乙亚硝脲(Carmustine，BCN∽等亚硝脲类药物的耐药密切相关，并影响肿瘤的化疗效果和病人的预后。探讨通过特异性封闭MGMT基因，抑制MGMTmRNA的表达，达到逆转MGMT的目的，是MGMT研究的热点。目前MGMT基因治疗的策略主要有：使用MGMT酶活性抑制剂、核酶技术、反

2、义RNA技术。RNAi(RNAinterference)技术是诱导基因沉默的一种新技术。RNAi白诞生以来，不仅应用于基因功能分析，而且作为基因治疗的一种方法，在肿瘤学研究领域中获得了较大进展。本课题从三个方面对MGMT进行了系统研究：①MGMT在胶质瘤组织、胶质瘤细胞系／株中的表达及其与MGMT基因启动子区甲基化之间的关系；②构建3条针对MGMT的siRNA质粒载体；③采用脂质体体外转染T98细胞系，观察转染后肿瘤细胞中MGMT的表达情况及其对BCNU敏感性的变化。第一部分MGMT在胶质瘤组织、胶质瘤细胞系／株中的表达及意义目的研究MGMT在胶质瘤组织、胶质瘤细胞

3、系／株中的表达及其与MGMT基因启动子区甲基化之间的关系。方法研究对象为13株人脑胶质瘤细胞系／株、35例临床胶质瘤患者DNA修复基因MGMT沉默对人脑胶质瘤化疗的影响中文摘要的肿瘤组织。采用美国Gentra公司的试剂盒以盐析法提取基因组DNA，并采用美国Chemicon公司CpGenomeTMDNA修饰试剂盒对组织DNA进行亚硫酸氢盐修饰，采用甲基化特异性PCR法(Methylation—specificPCR，MSP)进行MGMT基因启动子区甲基化水平的检测；采用sulforhodamineB(sm3)Colorimetric抗癌药筛选法测定人脑胶质瘤细胞系／株

4、对BCNU的敏感性；采用免疫组化的方法来检测胶质瘤患者肿瘤组织标本中MGMT蛋白的表达程度。结果13株胶质瘤细胞系／株中有8株存在MGMT基因启动子区甲基化，其中有7株对BCNU敏感，1株耐药；其余5株为MGMT基因启动子区去甲基化，均对BCNU耐药。用Spearman相关系数分析：P<0．05；按性别分组，男性患者的肿瘤组织MGMT蛋白表达阳性率为59．1％(13／22)，女性患者的肿瘤组织MGMT蛋白表达阳性率为69．2％(9／13)，男女两组间差异无统计学意义，P>O．05；按年龄分组，≤53岁年龄组、>53岁年龄组患者组织的MGMT蛋白表达阳性率分别为66．

5、7％(12／18)、58．8％(10／17)。两组间MGMT蛋白表达率差异无统计学意义，P>0．05；按病理分级分组，病理分级I级、II级、ⅡI级、Ⅳ级患者组织的MGMT蛋白表达阳性率分别为100．O％(2／2)、53．8％(7／13)、61．1％(11／18)、100％(2／2)，采用非参数多个独立样本秩和检验来进行统计分析，各组间MGMT蛋白表达阳性率差异无统计学意义，P>O．05；在35例胶质瘤患者的肿瘤组织标本中，22例MGMT蛋白表达呈阳性的胶质瘤组织中7例组织MGMT基因启动子区甲基化，阳性率为31．8％；13例MGMT蛋白表达呈阴性的胶质瘤组织中11例

6、组织MGMT基因启动子区甲基化，阳性率为84．6％。用Speanllall相关系数分析：P

7、化，MGMT蛋白表达较高。第二部分MGMT基因RNAi质粒载体的构建及鉴定目的构建MGMT基因的siRNA(smallinterferingm,aA)质粒载体pRNAT．H1．1／Neo．MGMTsiRNA，为进一步研究siRNA对MGMT基因的抑制作用，探讨MGMT在胶质瘤的化疗耐药及逆转胶质瘤细胞耐药表型中的作用奠定基础。方法针对MGMT的靶序列设计合成三条shRNA(smallhairmqA)的DNA模板单链，同时模板链两端分别设计BamHI和HmdIII限制酶切位点。退火形成siRNA载体插入片断。用限制性内切酶将pRNAT．H1．1／Neo线性化，T4