牛源无乳链球菌sip基因编码抗原表位序列的原核表达与其初步应用研究

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1、摘要目的构建无乳链球菌sip基因编码抗原表位序列的原核表达载体，在大肠杆菌中表达，并对其表达蛋白的免疫学活性及其应用进行研究。方法提取无乳链球菌临床分离菌株基因组DNA，根据GenBank公布的无乳链球菌sip基因序列，应用DNAStar软件Protean程序预测sip基因抗原表位、亲水性和抗原性指数等参数，并设计引物，PCR扩增出sip抗原表位基因。将其插入至表达质粒pET-30(a)的多克隆位点(MCS)，构建重组表达质粒sip-pET，以常规转化方法将sip—pET转入E．coli／BL2I(DE3)，IPTG诱导表达并优化诱导表达条件，应用SDS．PAGE电泳分析表达蛋白图谱，

2、Western-blot技术验证重组蛋白的免疫活性。运用Ni2+亲和层析法在自然条件下纯化重组蛋白，并建立间接ELISA方法，应用该方法对无乳链球菌全菌体裂解免疫制剂免疫的家兔血清抗体滴度进行检测。结果结果经测序和酶切分析表明，克隆获得了无乳链球菌sip抗原表位编码序列，且插入片段读码框架正确，原核表达重组质粒构建成功。经IPTG诱导，BL21(DE3)／sip．pET系统表达出相对分子质量为40KD的可溶性融合蛋白(表达量占菌体总量的43．8％)。Western．blot证实了重组蛋白的免疫活性。纯化后蛋白含量为5．09rng／ml，间接ELISA方法检测3次免疫后58d的血清免疫组

3、抗体滴度达到l：3200，免疫70d后仍保持较高抗体滴度。结论成功克隆牛源无乳链球菌Sip抗原表位序列，该序列897bp，编码299个氨基酸残基，构建的重组表达载体在大肠杆菌中获得高效可溶性表达，并建立了检测无乳链球菌免疫制剂免疫抗体滴度的间接ELISA方法，为迸一步研究SIP抗原表位重组蛋白免疫原性及无乳链球菌疫苗免疫效果研究奠定了基础。关键词：牛源无乳链球菌；sip基因；原核表达：纯化：间接ELISA；抗体检测Study0ntheProkaryoticexpressionandPreliminaryApplicationofCodingRegionGeneofSipEpitopeo

4、fStreptococcusagalactiaeFromBovineObjectivToconstructprokaryoticexpressionvectorofsipgene，expressnmEschefichiacoliBL21，andstudytheimmunocompetenceandapplication·Me‰dsG朗以mcDNAwasextractedfromstreptococcusagalactiae，epitopesites’hv出ophilicityandantigenicindexparametersWel'OpredictedbyDNAStarProt锄p

5、r0肿accordingt0mereleV锄tnucleotidesequencefromGcrd3ank,andapairofspecil：icpnmefsw硒designedtoamplifytheepitopeofsipgencbyPCR．Thefragmentwasclonedintothe舢ltiplecloningsite(MCS)ofpET-30(a)，formingtherecombinantproka叩tlcexp淄810nvector(sip-pET)．Therecombinantplasmidsip-pETwastransformedintoE．coliBL21(

6、DE3)bvcom二onmetllod锄dtheBL21(DE3)／pETWaSinducedbyIsopropyl⋯PDthioglactoslde(口IG)tOexpressfusionprotein，optimizetheexpressioncondition·ThentheeXp嘲sedDroteiIlSinE．coliBL21(DE3)wereanalyzedwithSDS—PAGEelectrophoresis．we5t锄blottingwaspe晌medtoidentifythehTlmuneactivefusionprotein·The舢mblIlaIltprotein

7、waSpurifiedwithimmobilizednickeionaffinitychromatography,andaIl1ndlrectenz啪elinkedimmunosorbentassaywasdeveloped．TakingthismethodtoteStthes舢1titerSofvaccinatedrabbitswhichwereimmunizedwithimmunepharmaceuticsotstreptococcusag