重组杆状病毒介导的人组织激肽释放酶在昆虫细胞中的表达

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1、张茹君重组杆状病毒介导的人组织激肽释放酶在昆虫细胞中的表达重组杆状病毒介导的人组织激肽释放酶在昆虫细胞中的表达研究生：张茹君导师：孙怀昌教授中文摘要昆虫杆状病毒表达系统是应用广泛的外源蛋白表达系统。该系统利用杆状病毒多角体蛋白基因的强启动子，不仅重组蛋白的产量高，而且具有真核细胞的蛋白质翻译后修饰加工机制，重组蛋白的生物活性较强。本研究用高保真PCR，从已被证明能在真核细胞中正确表达的重组载体中扩增人组织激肽释放酶cDNA，引入适当的酶切位点和组氨酸纯化标签后，与杆状病毒转移载体pFastBacl连接，用获得的重组载体pFastBac。K．LK

2、l转化含穿梭载体Bacmid的DHl0Bac大肠杆菌，筛选获得了重组质粒Bacmid．KLKl：再将Bacmid．ⅪLKl转染Sf9昆虫细胞，获得了重组杆状病毒；经3次传代后经间接免疫荧光检测证明，重组病毒感染的昆虫细胞中为重组人组织激肽释放酶表达阳性，经westernblot检测证明表达产物的分子量为预期的35kDa，大部分存在于胞浆内。这些研究结果为人组织激肽释放酶检测试剂的研制和开发利用奠定了基础。关键词：人组织激肽释放酶；杆状病毒；昆虫细胞；表达扬州大学硕士学位论文2ExpressionofRecombinantHumanTissueK

3、allikreinUsingBaculovirus—InsectCellExpressionSystemM．D．Candidate：RujunZhangSupervisor：ProLHuaichangSunAbstractThebaculovirus·insectcellexpressionsystemhasbeenextensivelyusedtoexpressrecombinantproteins，withrelativelyhighyieldsandauthenticpost·translationalmodificationsofthe

4、．expressedproducts．Toexpressrecombinanthumantissuekallikrein(KLKl)usingthebaculovirus-insectcellexpressionsystem，theklklcDNAwasamplifiedbyhighfidelityPCRfromarecombinanteukaryoticexpressionvectorpOV4kwithsuitablerestrictionsitesand6xHistagintroduced．Afterdigestionwithrestric

5、tionenzymesBamHIandXhoI，thePCRproductwassubclonedintobaculovirustransfervectorpFastBaclandtheresultantrecombinantvectorpFastBacl-KLKlwasintroducedintoDHl0BacE．colicontainingtheshuttlevectorBacmid．Bysite-specifictransposition，theklklcDNAwasintegratedintoBacmidandtherecombinan

6、tshuttlevectorBacmid—klklwasgenerated．Bytransfectionofsf9cellswithBacmid．KLKl，therecombinantbaculoviruswasobtained．Afterinfectionofs／9cellswiththerecombinantvirusfor3passages，therecombinantenzymewasdetectedbyindirectfluorescenceassayandWesternBlotwiththeexpectedmolecularweig

7、htof35kDa．Mostoftherecombinantproteinwaspresentinthecytoplasm．ThesuccessfulexpressionofrecombinantKLKllaidafoundationfordevelopmentofreagentsforKLKlidentificationandfunctionalstudies．Keywords：Humantissuekallikrein；Baculovirus；Insectcell；Expression张茹君重缀秆状病毒介导的入组织激肽释放酶在昆虫细臆中静表

8、达3英文缩写AAmpbpC英文全名Adeninecarbondioxidedegenningdeionizedwaterdeoxyribonuclei