tatbpigb融合蛋白原核表达载体的构建研究

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1、原创性声明J／僦Y1㈧8349№3“6⋯1本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本声明的法律责任由本人承担。学位论文作者：日期：年月日学位论文使用授权声明本人在导师指导下完成的论文及相关的职务作品，知识产权归属郑州大学。根据郑州大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅；本人授权郑州大学可以将本学位论文的全部或部分编入有

2、关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或者其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。本人离校后发表、使用学位论文或与该学位论文直接相关的学术论文或成果时，第一署名单位仍然为郑州大学。保密论文在解密后应遵守此规定。学位论文作者：日期：年月日中文摘要TAT-BPI．gB融合蛋白原核表达载体的构建研究硕士研究生赵院霞导师阚全程教授郑州大学第一临床学院药学部郑州450052为了有效减少细菌的抗药性，促进对感染细胞内细菌有效清除，尤其是针对革兰阴性菌感染，研究对抗内毒素特异有效的制剂。本实验利用①人体免疫缺陷病毒(HumanImmunodefidencyV'masHIV)的逆转录因子(tram—

3、activatorTAT)蛋白的功能．促进HIV病毒进入分裂或未分裂细胞；②巨细胞病毒(HumancytomegalovimsHCMV)严格的细胞嗜性．特异性与单核巨噬细胞结合。拟将HCMV结合受体膜糖蛋白gB中保守基因ADl及具有泛嗜性TAT蛋白与BPI基因融合表达，旨在赋予修饰后BPI一个新的功能：可以高效率穿透细胞膜或者多种屏障，如血脑屏障或菌膜，同时利用巨噬细胞的导向作用使融合蛋白具有中和不同解剖分布状态的LPS的功能，结果在于①对LPS．LBP、LPS．HDL有中和作用，具有延时保护效果；②细胞内感染细菌有清除作用，预防感染的复发；③中和活性较单纯BPI进一步提高；④提

4、高BPI的渗透作用，有利于治疗各种难治性感染；⑤改变普通抗生素的作用机制，减少细菌产生抗药性，从而为临床脓毒症及败血症、内毒素血症等的治疗找到一条新的有效途径。目的：为使BPI能高效率穿透细胞膜或多种屏障，中和不同解剖部位的LPS，构建TAT．BPI．ga原核表达载体并鉴定，为研制以BPI为基础的多肽抗生素打下基础。方法：1．BPIeDNA片段的扩增：PMN提取，Trizol提取细胞总鼢峪，将RNA转录为eDNA，利用特异性BPI引物进行PCR得至IJBPIDNA片段。2．pUC57-TAT．BPI重组质粒的构建：将人工合成的n盯互补单链混合，得到双链片段。将TAT双链片段经Pa

5、eI、SalI双酶切后，与pUC57载体连接，中文摘要构建pUC57．n盯重组质粒。将PCR扩增得到的BPI片段用SalI、KpnI双酶切后，与重组质粒pUC57-TAT连接，电转化感受态细菌DH5a，提取质粒并鉴定。3．gBDNA片段的扩增：依据Gencbank@GQ166969提供的UL55基因序列，人工合成人巨细胞病毒糖蛋白gB的UL55编码中ADl序列，利用gB引物进行PCR扩增得到该DNA片段。4．pUC57-TAT—BPI-ga融合蛋白载体的构建：将PCR扩增得到的gB片段用KpnI、EcoRI双酶切后，与重组质粒pUC57-TAT-BPI连接，电转化感受态细菌DH5

6、a，提取质粒并酶切及测序鉴定。5．同源性分析：应用计算机blast软件将重组蛋白TAT-BPI．gB与Genebank中n盯(YGRKKRRQRRR)序列、gB序列UL55(28个氨基酸)和BPI全序列AF322588中N端(1-597基因片段)等参照序列进行同源性分析比较。结果：1％琼脂糖凝胶电泳显示BPI基因大小约600bp、ga基因约80bp。pUC57-TAT-BPI和pUC57-TAT-BPI．ga重组质粒经PCR和酶切鉴定，1％琼脂糖凝胶电泳结果显示条带在600bp和700bp左右。同源性分析"汀序列中，第10，30位核苷酸有突变，核苷酸同源性为93％，氨基酸同源性为

7、90％；在BPI序列中，234，454，495，556位核昔酸有突变，核苷酸同源性为98％，氨基酸同源性为95％；在gB序列中，15，27，36，43，53，61，74位核苷酸有突变，核苷酸同源性为91％，氨基酸同源性为93％。结论：1．从肺炎患者中性粒细胞中，利用逆转录PCR技术扩增出BPIN端基因片段。2．将TAT、BPI基因片段克隆至IJpUC57载体中，并进行PCR、酶切及DNA序列分析鉴定，成功构建了仉盯．BPI融合蛋白的原核表达载体。3．将gB基因片段克隆至UpTAT