靶向stathmin与bcl此同时2基因rnai慢病毒载体的构建

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1、飞·一≮气、1'徐州医学院硕士学位论文缩略词心bpcDNADEPCddH20DMSO心11PEDTAEGFPGAPDHIC50IRKanLBmRNANCNeoODPBSPCR缩略词表Abbreviation英文全称中文全称／㈣删㈣㈣Y184j5iicji糊。alkalinephosphatase碱性磷酸酶Basepairs碱基对Diethylpyrocarbonate互补DNA焦碳酸二乙酯doubledistilledwater双蒸水dimethylsulphoxide二甲亚枫deox舛bonucleosi

2、detriphosphate脱氧核糖核酸ethylenediaminetetraaceticacid乙二胺四乙酸enhancegreenfluorescentprotein增强绿色荧光蛋白glycetaldehyde-3-phosphate甘油酸-3-磷酸脱氢酶50％inhibitingconcentration细胞半数抑制浓度inhibitionratioKanamycin细胞生长抑制率卡那霉素luria-bertanimediumLB培养基messengerribonucleicacid信使核糖核酸ni

3、trocellulosefiltermembrane硝酸纤维过滤膜Neomycinopticaldensity新霉素光密度Phosphate-bufferedsaline磷酸盐缓冲液polymerasechainreaction聚合酶链式反应～kI‘徐州医学院硕士学位论文RN加siRNAstlI之NAshorthairpinRNA2RNAisiRNAshRNA飞l．‘徐州医学院硕士学位论文靶向stathmin与bcl．2基因RNAi慢病毒载体的构建中文摘要目的构建同时携有bcl．2与stathmin基因小发

4、卡RNA(shorthairpinRNA，shRNA)干扰的慢病毒表达载体，为进一步观察沉默stathmin与bcl．2基因逆转紫杉醇耐药的可行性做前期的准备工作。方法1．shRNA表达框片段的获得。设计引物引入XbaI、XhoI酶切位点，分别以前期实验构建的表达质粒pGPHl／GFP／Neo-stathmin、pGPU6／GFP／Neo-bel一2、pGPU6／GFP／Neo-NC(NC为非特异性序列)为模板，通过PCR扩增出由Hl启动子调控的shRNA表达框片段(H1．stathmin)、U6启动子调控

5、的shRNA表达框片段(U6．bcl．2)及(U6．NC)。2．应用XbaI、XhoI双酶切PCR产物shRNA表达框片段(H1．stathmin、U6．bcl．2、U6．NC)和慢病毒转移质粒PLB，将酶切纯化后的shRNA表达框片段与线性化的慢病毒干扰质粒PLB分别连接，获得重组载体PLB．bcl．2／shRNA、PLB．stathmin／shRNA与PLB．NC／shRNA。3．用BamHI、EcoRI．HF双酶切重组载体PLB．bcl．2／shRNA、PLB．stathmin／shRNA，取重组载体

6、PLB-bCl．2／shRNA酶切大片段和重组载体PLB．stathmin／shRNA酶切小片段连接，获得重组载体PLB．bcl．2．stathrnin／shRNA。4．采用阳离子脂质体法将重组载体PLB．bel．2．stathmin／shRNA、包装质粒ANRF和包膜蛋白质粒pVSVG共转染293Fr细胞，根据绿色荧光蛋白测定病毒滴度，转染后48h、72h收集病毒上清，获得重组慢病毒PLB-bcl．2．stathmin／删A。结果1．构建出慢病毒干扰载体PLB．bcl．2／shRNA、PLB．stathm

7、in／shRNA和PLB．NC／shRNA(阴性质粒)，经PCR、酶切鉴定及测序证实正确。2．构建出慢病毒干扰载体PLB．bel．2．stathmin／shRNA，经酶切鉴定、测序证实正确。3．慢病毒干扰载体PLB．bcl．2．stathmin／shRNA、包装质粒ANRF和包膜蛋白粒VSV-G共转染293FT病毒包装细胞后，荧光显微镜下观察到较强的绿色荧光蛋白表达，表明慢3‘■’徐州医学院硕士学位论文病毒颗粒正确包装。结论1．成功构建出慢病毒干扰载体PLB-bcl．2／shRNA、PLB．stathmin

8、／shRNA和PLB-NC／shRNA。2．成功构建出慢病毒干扰载体PLB．bel．2．stathmin／shRNA。3．完成了PLB．bel．2．stathmin／shRNA慢病毒载体包装细胞系的建立。关键词RNAi；shRNA；慢病毒；bel．2；stathmin4徐州医学院硕士学位论文ConstructionofaRNAiLentiviralvectortargetingstathminandbcl--2g