假单孢菌外毒素蛋白pe38的诱导表达和抗人膀胱癌免疫毒的构建和诱导表达

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1、南京医科人学硕-上学位论文中文摘要享心盘西新{、锢舂．第—部分：删节的假单孢菌外毒素基因PE38的诱导表达．PE38是一种删节的假单孢菌外毒素A。它缺失了细胞结合区，但仍保留了结构域Ⅱ和结构域Ⅲ毒素移位和酶活性功能。本研究对美国国立卫生院赠送的PE38基因进行了序列测定，测序结果与Genbank中已发表的完整的PE结构基因序列进行了比较。f比较结果说明PE38与全序列相比缺失了结构域Ia和结构域Ib36}_380的氨基酸残基。为了表达PE38基因，将PE38基因表达质粒PMS8-38f+T转化进入大肠杆菌BL21(入DE3)。PMS8．38F叮具有17强启动子，经I

2、PTG诱导培养，超声破碎细胞后，SDS—PAGE分析超声上清(可溶性蛋白)和沉淀(包涵体)。目标蛋白大部分存在于超声上清，分子量约为38KDa。为了得到大量表达的可溶性蛋白，我们找到了适宜的表达条件：在LB培养基中，BL21菌37。C下培养至菌体浓度oD650值为0．6-0．8，加入IPTG至终浓度为0．4mM。37℃下诱导60分钟，PE38毒素蛋白得到了高效表达，表达产物9070以上为可溶性，约占菌体总蛋白的11％，平均每m1菌液可收获37ug。这样为后面免疫毒素的构建和表达，以及活性的测定奠定了基础。卜—卜一一第二部分：抗人膀胱癌单链免疫毒素的构建和表达．侥疫毒

3、素是指将抗体与毒素蛋白相融合而产生的一种大分子蛋白，其中抗体部分主要负责引导毒素蛋白与靶抗原特异性结合，而毒素部分则主要是实施对细胞的杀伤作用≯每实验利用DNA重组技术，将抗人膀胱癌单链抗体基因与经删节的假单孢菌外毒素蛋白PE38基因相融合并克隆到大肠杆菌表达载南京医科大学硕1‘学位论文体中进行表达，从而产生重组的单链免疫毒素。僧先利用设计合成的核苷酸片段置换PAL一781中的多克隆位点j改造后的质粒称为PAHM。根据抗人膀胱癌单链抗体(scFv)具有的信号肽PelB序列和V，基因的FR4序列特点，设计出5’端和3’端PCR引物，从已构建的PWAl80．PG载体中扩

4、增出抗人膀胱癌scFv基因。同时，通过适当的限制内切酶，将PE38基因从PMS8．38f+T质粒中切下来。扩增出的单链抗体基因与PE38基因分别装入PAHM载体中，转化子经筛选，酶切鉴定，最后序列测定证实己成功构建抗人膀胱癌免疫毒素的表达载体，称之为PAGIT。将己构建好的抗人膀胱癌单链免疫毒素用NdeI和EcoRI酶从PAGIT中切下，装入本实验室构建的表达质粒PTMF中，新的表达质粒成为PTIT。把PTIT质粒转化至大肠杆菌表达菌种BL21(入DE、)，在37℃下IPTG诱导表达5小时。超声破碎细胞后，SDS．PAGE分析超声上清(可溶性蛋白)和沉淀(包涵体)。

5、结果表明，表达产物在上清与沉淀中都存在，分子量约为，与估计值相符。以可溶性表达产物进行细胞毒性实．79验，／结_g果Da表明表达产物能够较特异抑制人膀胱癌细胞的生长，靶细胞抑制率为36％，对其他肿瘤细胞毒性作用则很小。这提示目标蛋白对人膀胱癌细胞具有特异的毒性作用。主题词：抗人膀胱癌单链抗体，免疫毒素，PE38，PE。南京医科人学硕J：学位论文Abstract勘驰咖ofPE38protein，thetrunealedPseudomonasExotoMnProcedureshavebeendevisedforproducinghi曲yieldsofPE38，aprot

6、einimportantforthedevelopmentofanti—cancertherapy．PE38isatruncatedformofthebacterialtoxin，PseudomonasExotoxinA；Itlacksthecell—bindingdomain，butretainsdomainIIanddoaminIIIthatareinvolvedinmembranetranslocationandinhibitionofproteinsynthesisineukaryoticcells．Inourexperiments，thePE38genew

7、assequencedandcomparedwiththecompletePEstructualgene．PMS8—38f．+，EplasmidsencodingPE38geneweretransformedintoE．coliBL21(入DE3)．ExpressionvectorssynthesizedtheproductasasolubleproteinundercontroloftheT7promotegInordertoobtainlargeamountofsolubleexpressingproduct，theoptimalconditionwasfo