七氟烷对成年神经再生的作用和机制分析

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1、中文摘要二抗孵育，DAPI复染细胞核，在荧光显微镜下观察，红色荧光阳性的细胞即为Nestin阳性成年神经干细胞，蓝色为DAPI染色的细胞核。4、实验方法4．1七氟烷处理神经干细胞细胞铺板，2小时后在显微镜下观察细胞是否贴壁，贴壁后，将细胞放入预先制备的密闭容器中，容器中七氟烷浓度分别为1．3％，1．9％，2．7％和3．3％(容器内还含5％C02，20％02，并在一个大气压下用氮气平衡)，其中1．3％为低浓度组，1．9％和2．7％为中浓度组，3．3％为高浓度组，不含七氟烷作为空白对照组，继续培养细胞2小时。4．2神经干细胞核染色和

2、细胞计数细胞固定后，加入DAPI染色15分钟。每组重复计数4孑L细胞，每孔细胞镜下(400×)随机选择四个视野，进行细胞计数，并相加作为该孔的细胞总数。每组4孔的细胞总数相加后取平均数代表该组的细胞总数，空白组的细胞经标准化处理后记为100。4．3免疫印迹CREB和pCREB的表达水平用免疫印迹方法测定。将细胞分为三组：空白组(不加任何处理)，低浓度七氟烷组(1．3％七氟烷处理)和中浓度七氟烷组(1．9％)。含lmMNa3V04预冷的PBS洗细胞2次，再用预冷的缓冲液裂解细胞，收集细胞裂解液，SDS．PAGE电泳分离后转印于PV

3、DF膜上，5％脱脂奶封闭后，将PVDF膜与含CREB(1：1000)或pCREB(1：1000)抗体的3％BSA中4。C孵育过夜，再分别加入二抗和化学发光试剂，获得图像。观察pCREB和CREB灰度比值来评判CREB的磷酸化水平，空白对照组比值标准化为100，其余组依此标准化。5．统计方法各组数据应用采用SPSS13．0统计软件进行分析，所有实验数据均采用平均IV硕士学位论文数士标准误(Mean+SE)表示，检验方差齐性后(P>0．05)，采用单因素方差分析(One．WayANOVA)的统计学方法，P

4、，各组均数间的多重比较采用LSD法(Least．significantdifferencetest)。结果1．大鼠腹腔注射七氟烷对齿状回神经元增殖的影响应用LSD法对各种新生神经元数量进行组间比较，应用3．5ml／kg七氟烷的缺血组与假手术组和生理盐水对照组均存在统计学差异，应用7ml／kg七氟烷大鼠的缺血组与假手术组和生理盐水对照组也均存在统计学差异，分别应用3．5ml／kg和7ml／kg七氟烷的缺血组之间存在统计学差异，两假手术组与生理盐水对照组不存在统计学差异。2．大鼠成年海马神经干细胞的体外培养及鉴定体外培养的成年神经干

5、细胞表达Nestin蛋白，阳性率为99％。3．七氟烷促进成年神经干细胞增殖低浓度七氟烷组(1．3％)无促进ANSCs增殖的作用，而中浓度组(1．9％和2．7％)与空白对照组相比，明显可以促进ANSCs增殖(P

6、水平。中浓度组七氟烷明显上调ANSCs中p-CREB／CREB的比值。结论1、腹腔给予四血管夹闭大鼠全脑缺血模型七氟烷3．5ml／kg和7．0ml／kg均可促进大鼠海马齿状回的新生神经元数目增多，说明七氟烷可以促进成年神经再生，且这种促进作用可能具有浓度依赖性。本研究中七氟烷对假手术组大鼠的成年V中文摘要神经再生无明显影响，这可能是由于七氟烷产生成年神经再生作用需要一定的刺激。2、在本研究的体外实验中，我们发现七氟烷在中浓度(1．9％和2．7％)和高浓度(3．3％)可以促进ANSCs的增殖，而空白对照组和低剂量(1．3％)无明显

7、作用。证明了七氟烷可以促进的ANSCs增殖。3、CREB的磷酸化与ANSCs的增殖一直是密切相关的’。本研究结果表明七氟烷可能是通过改变CREB的活性，达到促ANSCs增殖的作用。关键词成年神经再生七氟烷细胞增殖CREBVI硕士学位论文TheEffectandMechanismofSevofluraneinAdultNeurogenesisName：Supervisor：Prof．GuMiaoningABSTRACTBackgroudandStudy0bjectiveOneofthecentraldogmasofneurosci

8、ence，thattheadultmammalianbrainwasunabletofacilitateneurogenesis，andthatnerveinjuryordamageWasirreversible．In1960sand1970s，somerese