nogob在lps诱导的巨噬细胞免疫应答中的作用及其机制初探

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1、Nogo-B在LPS诱导巨噬细胞免疫应答中的作用及其机制初探摘要背景：急性肺损伤(Acutelunginjury，ALI)是呼吸系统常见的危重症之一，微生物感染、外伤、毒气、污染物、自身抗体、胃酸、栓塞和自由脂肪酸等多种生物、物理和化学因素均可导致ALI。尽管在过去几十年中人们对ALI的认识不断加深，在治疗上也取得了重大进步，但ALI的死亡率(约27％到45％不等)仍居高不下，且ALI的发生、发展机制也尚无定论。鉴于当前临床上ALI患者面临着高死亡率、低治愈率和差的生活质量的现实，探明ALI的病理生理机制从而找到有效的治疗措施迫在眉睫。肺泡巨噬细胞(A

2、lveolarMacrophages，AM)作为肺部主要的固有免疫细胞，在ALI的发生、发展中起着关键作用。众所周知，巨噬细胞是免疫系统的重要成分之一，参与了各种炎症的固有免疫应答和适应性免疫应答，此外，在损伤修复、组织重构及纤维化等过程中也起着重要作用。Nogo—B是网状蛋白家族(reticulonsuper．familyproteins，RTNs)中的成员，因参与了多种细胞生物学过程，近来成为了国内外的研究热点，研究发现Nogo．B可以调节巨噬细胞的募集，调控巨噬细胞迁移、粘附、吞噬、炎症因子分泌及杀伤作用等生物学功能，同时内源性的Nogo．B还可

3、能与巨噬细胞的活化和转运有关。然而，在ALI状态下，Nogo．B是如何调控巨噬细胞的免疫应答目前尚不明确。我们在前期的研究中观察到ALI小鼠的肺泡灌洗液(Bronchoalveolarlavagefluid，BALF)细胞中，肺气道、血管及肺泡上皮组织@Nogo．B的表达水平均较正常小鼠降低，以BALF细胞降低最为显著，而BALF中的细胞成分主要为AM。因此，我们推澳lJNogo．B对AM的功能发挥起着至关重要的作用。为了证实上述推论并初步阐明其分子机制，本研究选用小鼠巨噬细胞株RAW264．7为研究对象，在LPS束U激下研究Nogo．B对巨噬细胞分泌

4、、迁移、抗原提呈等免疫应答过程的影响并初步探讨其机制。7j法：一、选择小鼠巨噬细胞株RAW264．7作为本实验的研究对象，加入胎牛血清、青霉素和链霉素的DMEM培养基在37"C，5％C02浓度的培养箱中进行培养。用Westernblot检测巨噬细胞RAW264．7内不同LPS浓度下以及LPS刺激后不同时间段内Nogo．B表达水平。二、分别采用腺病毒转染和siRNA干扰的方法上调和下调巨噬细胞中Nogo．B的表达水平，选择LPS刺激的最佳浓度和时长，采用ELISA方法检测巨噬细胞炎症因子的释放情况，Transwell实验观察巨噬细胞的迁移能力的变化，流式

5、细胞术检测巨万方数据第二军医大学硕士学位论文噬细胞表面MHCHI进而评估其抗原提呈能力，以及WestemBlot方法检测MSRl进而判断巨噬细胞的吞噬能力。三、探索LPS刺激下Nogo．B影响巨噬细胞功能可能的机制。采用流式细胞术检测不同Nogo．B表达水平的巨噬细胞表面TLR4的表达情况，WesternBlot方法检测不同Nogo．B表达水平的巨噬细胞中MAPK通路相关分子ERK、JNK和P38的磷酸化水平，以初步阐明Nogo．B通过TLR4．MAPK通路调控巨噬细胞的生物学功能。结果：一、LPS诱导巨噬细胞表达Nogo-B的变化规律巨噬细胞Nogo

6、．B蛋白随着LPS刺激浓度的增高而降低，即Nogo-B蛋白的表达水平呈现LPS浓度依赖性降低，在LPS浓度为199／ml时降至最低。当LPS刺激浓度为199／ml时，巨噬细胞中Nogo-B的表达水平随着LPS刺激时间的延长而逐渐下降，在刺激后的24h其表达量降至最低并一直持续到48h。二、LPS刺激后，调控Nogo．B表达对巨噬细胞免疫应答的影响(一)、LPS刺激后，过表达Nogo．B的RAW264．7炎症因子TNF．Q，MCP．1和TGF．D的分泌均较对照组显著增加：而低表达Nogo．B的RAW264．7炎症因子TNF．Q，IL．1D，MCP．1和T

7、GF．D的分泌水平显著受到抑制。(二)、LPS刺激24h后，过表达Nogo．B的RAW264．7迁移能力较对照组升高1．8倍；而低表达Nogo．B的RAW264．7则迁移能力较对照组减低1．5倍。(三)、LPS刺激后MHCII在过表达Nogo—B的RAW264．7中表达量随着LPS刺激时间的推移显著增加，而在低表达Nogo．B的RAW264．7中，MHCII的表达量显著低于对照组。调控Nogo．B的表达水平，MHCI的表达未见明显变化。(四)、LPS刺激后24h，MSRl在过表达Nogo．B的RAW264．7中其表达量明显升高，而在低表达Nogo—B的

8、RAW264．7中显著减少。三、Nogo-B影响巨噬细胞表面TLR4的表达并调节MAPK通路的