水通道蛋白―7在小鼠肾集合管发育过程中的表达分析

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1、水通道蛋白一7在小鼠肾集合管发育过程中的表达分析［摘要］目的探讨水通道蛋白-7(aquaporin-7,AQP-7)在小鼠肾集合管发生发育过程屮的表达和作用。方法采用免疫组化结合体视学测量和免疫印迹技术，测定胚龄(E)16、18d胎鼠及生后(P)1、3、5、7、14、21、42、70d仔鼠肾集合管中AQP-7的表达及含量变化。结果通过体视学测量和免疫印迹技术结果显示：AQP-7在胚龄16d的小鼠肾集合管开始弱表达，到生后21d达到高峰，之后随着日龄的增加，表达无明显变化。结论AQP-7主要表达在发育屮小鼠肾集合管屮，可能和肾集合管的发育和成熟相关。［关键词］水通道蛋白-7;肾；集合管；

2、小鼠；发育水通道蛋白-7(aquaporin-7,AQP-7,也叫AQPap),AQP-7是从脂肪组织中分离鉴定出的一种水孔蛋白基因，其蛋白质是水通道蛋白家族中的一个成员。水通道蛋白普遍存在于微生物、植物、及动物界。AQP-7在肾脏中的表达水平较高，属于廿油水通道蛋白，同时对肾脏中水份的重吸收和尿液的浓缩都起着重要作用。有大量的研究表明，甘油水通道蛋白在允许水分子通过的同时也可以允许一些其它的中性溶质通过。甘油水通道蛋白在多种组织屮都有重耍的生理功能；例如在脂肪组织，上皮组织屮，特别是在细胞受损的快速增殖期能为其提供能量，而器官的发生发育也是细胞快速增值的过程。关于水通道蛋白在肾脏中发

3、生发育的文献报道有很多，其中与AQP-7属于同一亚家族的AQP-3在肾脏集合管表达的文献也很常见。基于这些，我们试想AQP-7也可能在肾脏集合管的发生发育中起到一定的作用。本研宄采用免疫组织化学和免疫印迹的技术探讨AQP-7在肾脏集合管的发育中的作用。1资料与方法1.1一般资料2015年3月〜10月期间由辽宁医学院实验动物中心提供的健康2月龄昆明小鼠(雌雄比例1:1),体重25g,随机合笼。观察到阴道栓脱落的最早时间计为胚龄(embryonicdays,E)0do观察到仔鼠出生的最早时间计为生后(postnatal,P)0d。孕鼠分为10组，每组3只，每只孕鼠取2只胎鼠或仔鼠。分别取胚

4、龄16、18d胎鼠和生后1、3、5、7、14、21、42、70d仔鼠各6只，共60只。兔抗小鼠AQP-7多克隆抗体购自Santa公司；SABC免疫组化试剂盒购自屮杉金桥生物技术有限公司；膜蛋白提取试剂盒、PolyvinylideneFluoride膜、SodiumDodecylSulfate等免疫印迹试剂均购白Sigma公司。1.2方法1.2.1肾脏标木制备用100g/L水合氯醛将麻醉后，立即剖开孕鼠腹腔将胎鼠取出，E16、18d胎鼠取左肾全肾固定。仔鼠断头处死后，从腹后壁取左肾，沿横轴将肾切成约3mm薄片，放人40g/L多聚甲醛固定，梯度酒精脱水，香柏油透明，石蜡定向包埋，做连续切片

5、，厚度5um。右肾均入冰丙酮迅速冷冻，-80°C保存，供免疫印迹使用1.2.2体视学测量以免疫组化染色切片进行体视学测量，每组选5张切片，每张切片按“s”形在汕镜下选取5个视野，应用方格测试系统，交点计数法测算集合管阳性反应表达的面密度值，其公式为：Sv=21x/Lc（Lc=ZPc?a），式中lx是阳性表达的胞膜与测试方格系统的交点数，Pc是测试系统落在参照系（集合管）的点数，a代表方格两点间距离，实际长度相当于0.1mm。1.2.3免疫印迹检测取各组冷冻待用的右肾称重，剪碎后，冰浴中加入膜蛋白抽提试剂，抽提膜蛋白，考马斯亮蓝法蛋白质定量。每种样品取20ug湿转到PVDF膜上。用100

6、g/L脱脂奶粉封闭，加AQP-7抗体（浓度1：200）4°C孵育过夜后，碱性磷酸酶标记的二抗（浓度1:600）摇床室温孵育lh,ECL显色，用FluorchemV2.0系统测定光密度值。1.3统计学分析采用SPSS16.0软件对研究所得数据建立数据库，计量资料以（x土s）表示，采用t检验，P〈0.05力差异有统计学意义。2结果2.1体视学测量结果通过对AQP-7免疫组织化学染色阳性切片（免疫组织化学染色图片本篇论文未显示）进行体视学分析得到如下结果：随着胚日龄的增加，AQP-7在集合管表达的面密度值逐渐增加，P7天后增加明敁，P21天达到顶峰后趋于稳定。见表1。2.2免疫印迹检测结果A

7、QP-7蛋白表达的电泳条带用GeneTools软件分析，测定光密度值，以测得的光密度最大值记为1，计算各组小鼠肾组织中AQP-7的相对表达量（百分数）。结果显示随着小鼠肾的发育AQP-7表达量逐渐增加，P7d后增加明显，P21d达到峰值后趋于稳定。经统计学分析，各组间数值的差异具有统计学意义（P〈0.05）,见表2。3讨论水通道蛋白是允许水和甘油等小分子通透的膜蛋白通道，以四聚体形式位于质膜上，每个单体含有一通道。水通道蛋白功能异常与很多疾病相