外周血染色体培养操作与分析

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1、外周血染色体培养操作与分析谢志威张晶李卫凯(江门市中心医院检验科细胞遗传室529023)【中图分类号】R446.1【文献标识码】A【文章编号】1672-5085(2012)26-0068-02【摘要】目的探讨外周血染色体培养的适宜操作方法，保证外周血细胞染色体培养的质量。方法无菌釆取肘静脉血，采用淋巴细胞培养液，在370C体外培养三天后收获染色体，G显带。结果2009年共培养成人外周血967例，培养成功率100%,染色体分散、显带效果好。结论外周血染色体培养操作过程复杂，影响因素多，规范操作步骤能保证染色体制备的重复

2、性和一致性，确保染色体制备质量，从而提高诊断结果的准确性。【关键词】外周血细胞染色体培养人体外周血淋巴细胞在植物凝集素(PHA)的刺激下，能转变为具有分裂能力的母细胞。外周血细胞经过含有PHA的培养液培养72小时后，再经过秋水仙素的处理，低渗和固定就可获得大量有丝分裂细胞，用空气干燥法制片，胰酶处理，吉姆萨染料显带，便能制备供显微镜分析的染色休标木。由于整个培养过稈操作比较繁琐，许多操作步骤对结果都有非常重要的影响，比如接种的血量,培养基的质量，培养的时间和温度，秋水仙素加入的时间和浓度、低渗的时间,预固定、固定的时

3、间以至制片时的温度和湿度等•木实验室经过长期的实践和总结，对培养的每个步骤都实行严格的标准化操作，取得良好的效果，具体方法如下：材料与方法1.材料：2009年来我院牛殖中心就诊的967名成人抽取外周血标木，湖北金杏肝素锂抗凝无菌采血管。2.方法2.1采血与培养无菌采取静脉血2〜3ml于肝素锂采血管中，混匀，标记姓名、编号。取外周血淋巴细胞培养基（RPMI1640）[l]室温复融，每例标本接种2瓶，每瓶接种0.4〜0.5ml血标本。置370C培养箱内培养68-72小吋。收获细胞前2小时，用5号针头加入25ug/ml秋水

4、仙素2滴[2],（培养基中秋水仙素的最终浓度为0.4ug/ml）o摇匀后继续培养2小时。2.2收获细胞培养箱中取出培养瓶：将培养的细胞移入：LOml刻度离心管中，标记姓名编号，以2000转/分钟，离心10分钟后弃上清。低渗处理：向离心管中加入10ml预温（370C）的0.075mol/LKcl低渗液，用吸管轻轻吹打,使细胞均匀悬浮于低渗液中，放冋37°C恒温水浴箱（或培养箱）中，静置25min,使白细胞膨胀，染色体分散、红细胞解体⑶。预固定：向离心管中加入固定液（甲醇：冰乙酸3：1）[4]2ml,轻轻混匀，在室温下放

5、置10分钟。固定：以2000转/分钟，离心10分钟，吸去上清液，留下沉淀物。沿离心管壁加入新配固定液10ml,混匀，室温放置30分钟。再固定：2000转/分钟，离心10分钟，吸去上清液，留下沉淀物。加入10ml固定液轻轻混匀，加盖拧紧4°C冰箱贮存。2.3制片、显带和染色1）制片：标本2000转/分钟，离心10分钟，弃上清，加入新配制的适量固定液（0.5〜lml）,用吸管轻轻吹打细胞团，制成细胞悬液，吸取2〜4滴细胞悬液滴于预冷的洁净载玻片上，每人制2〜3片，标记姓名及编号立即用口吹散，将制备的染色体标本片置鼓风干燥

6、箱内75°C3小时，取出后自然冷却至室温。2）显带：染色缸中的45ml生理盐水，加2.5ml浓度为0.25%的胰酶溶液（胰酶最终浓度0.013%）用3%Tris3〜5滴调整PH值为6.8-7.0,在37°C预热30分钟，将染色体标本片放入胰蛋白酶溶液中消化（恒温）。先将一张标本片分成三段进行预消化，以确定最佳消化时间，一般在2分30秒〜3分钟。3）染色：将消化过的染色体标本片立即放入10%Giemsa染色液中（40ml生理盐水中加入4.5mlgiemsa原液）染色3〜5分钟；自来水轻轻冲洗3〜5秒钟，晾干。4）核型分

7、析：显微镜下常规计数20个分裂相，分析3个G带核型，（异常者分析5个）。如遇到嵌合休加倍计数和分析⑸。结果培养967例成人外周血标本，全部培养成功，培养成功率100%,染色体分散、显带效果好。讨论由于整个培养过程操作比较繁琐，除了对培养的每个步骤都实行严格的标准化操作外，为确保染色体制备质量，一些细节也要注意：1.器皿洗涤一定要干净，不能有酸碱残留。否则会影响培养效果［6］。2•接种外周血量不能太多或太少。过多，细胞数目过多，营养不足，细胞易死亡。3•培养细胞温度37±0.5°Co温度过高或过低都不利于

8、细胞生长。4.秋水仙素一定要避光保存，配制后使用期不能超过半年。5.低渗的吋间、温度会影响染色体的分散和分裂相的数目。6•离心机最好使用水平式，转速过快或过慢直接影响标本制片的质量。7.固定液一定要现用现配，固定要彻底，每次不少于30分钟，加固定液不能过快，要沿管壁慢慢加入，否则染色体容易扭转，出现飘带样染色体；固定作用不足，染色体易出现毛刷状