临床医学毕业论文亲水液相色谱三重四极杆质谱联用法快速检测尿液和血浆中河豚毒素

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1、奎水液超色谱三重題极杆质谱联甩法快速检测麗液狸血＞中河豚毒素姓名：2014年6月25日亲水液相色谱三重四极杆质谱联用法快速检测尿液和血浆中河豚毒素【摘耍】建立了快速检测尿液和血浆屮河豚毒素的亲水液相色谱三重四极杆质谱联用分析方法。样品经乙腈沉淀、TSKgelAmide80亲水色谱柱分离盾，采用电喷雾串联质谱多反应监测(MRM)模式检测，基体匹配标准外标法定量。尿液和血浆样品的线性范ffl分别为3〜500pg/L和1-200pg/L，加标冋收率分别为96%〜108%和100%〜105%,相对标准偏差小于9%和16

2、%(n=6),样品的检出限分别为1.0和0.3)ig/L(S/N=3)。本方法简单、快速、灵敏、特异性强。【关键词】亲水液相色谱三重四极杆质谱法，河豚毒素，尿液，血浆1引言河豚毒素(Tetrodotoxin，TTX)系口本学者田原良纯1909年苜先从河豚鱼中发现，H前己分离出十多种类似物，其中河豚毐素为河豚鱼的主要毒性成分(见图1)。河豚毒素是一种毒性很强的的非蛋白类神经毒素，除存在于河豚负体内，还广泛分布于多种脊椎动物和无脊椎动物体内。河豚毒素进入人体后可抑制神经细胞膜对Na+的通透性，从而阻断神经冲动的传导

3、，使神经麻痹，严重者抑制呼吸从而导致死亡［1］。因此，建立快速、准确检测鉍液和血浆中TTX的方法其宥重要的现实意义。目前，TTX的检测方法主要有小鼠活体生物法［2］、免疫学方法［3］、液和色谱紫外检测法［4］、气相色谱质谱联用法［5］、液相色谱柱后衍生荧光检测法［6］及液质联用法［7〜9］等，这些方法多是针对河豚鱼中河豚毒素的含量测定。由于TTX的毒性极大，对于体重50kg的人，0.2mg就会引起中毒，2mg即可导致死亡，所以发生中毒吋尿液和血浆中TTX的浓度很低，在pg/L数量级上，常规方法无法检出。有报道采

4、用液和色谱柱后衍生荧光检测法［10］和液和色谱离子阱质谱联用法选择离子监测模式［11］测定屮毒病人尿和血屮TTX含景，方法的检出限为5gg/L；Kawatsu等［12］采用免疫亲和柱净化液相色谱柱后衍生災光法测定尿液屮TTX,检出限达2pg/L，但需要制备TTX单克隆抗体；Kurono等［13］采用固和萃取结合GCMSSIM法测定血浆巾TTX,检出限达0.1pg/L，但样品前处理方法复杂、费时。从方法原理上分析，气质联用法测定的是碱水解后能产生C9碱的TTX类似物的总和，而不仅仅是TTX,某些TTX类似物毒性相

5、差较大，如4,9脱水河豚毒素的毒性约为TTX的1/500［14］；Jen等［15］采用LCMS/MS测定血清ipTTX,检出限为0.1gg/L,定量限为1^g/L,但样品前处理比较复杂，需高速离心、固和萃取、冷冻干燥和超滤等步骤，一次进样运行40min,TTX在死时间附近出峰。本研究采用1%醋酸的乙腈沉淀蛋白，液相色谱三重四极杆质谱法测定尿液和血浆屮TTX。一次进样分析仅需13min,方法快速、简单、灵敏、选择性好，适合于TTX中毒的确证分析。图1河豚毒素及其类似物的化学结构（略）Fig.lChemicalst

6、ructuresofnaturallyoccurringtetrodotoxins（TTXs）2实验部分2.1仪器与试剂AquityUPLCQuattroPremierXE超高效液和色谱串联质谱仪配有电喷雾源（美国Waters公句），Masslynx4.1工作站；MS2旋涡浞旋器（徳WIKA公口J）;HUP100手待式超声波细胞破碎仪（天津恒奥科技发展宥限公司）；TGL16C高速台式离心机（上海安亭科学仪器厂）；GradientA10MillQ超纯水器（法国Millipore公司）。乙腈和甲醇（HPLC级，徳U

7、Merck公•口J）;甲酸铵（HPLC级，Fluka公口；］）;96%甲酸和冰醋酸（HPLC级，美国Tedia公司）；河豚毒素标准物质（纯度299%，大连瑞芳生化物品有限公司），用乙腈水配制成100mg/L标准贮备溶液，保存于一35°C冰箱中。2.2样品前处理方法吸取300pL尿液于盛有700pL1%醋酸乙腈溶液的1.5mLSafelock尖底离心管中，旋祸30s，以12000r/min离心5min，取上清液待测。同时在6支试管中分别按标准曲线的浓度加入适量标准溶液，加入空白鉍液至1000ML，混匀，吸取30（

8、^山与样品一起处理，制作工作曲线系列。吸取500pL血浆于10mL试管中，加入1.5mLl%醋酸乙腈溶液，用手持式超声波细胞破碎仪均质2min，以4000r/min离心4min,吸取1.0mL上清液于10mL试管中，50"C水浴氮气吹干,加入250pL流动相，超声1min，旋涡30s,上清液待测。同时在6支试管中分别按标准曲线的浓度加入适量标准溶液，加入空白血浆至500pL,浞匀，放置