亲水液相色谱三重四极杆质谱联用法快速检测尿液和血浆中河豚毒素

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1、亲水液相色谱三重四极杆质谱联用法快速检测尿液和血浆中河豚毒素【摘要】建立了快速检测尿液和血浆中河豚毒素的亲水液相色谱三重四极杆质谱联用分析方法。样品经乙腈沉淀、TSKgelAmide80亲水色谱柱分离后，采用电喷雾串联质谱多反应监测(MRM)模式检测，基体匹配标准外标法定量。尿液和血浆样品的线性范围分别为3～500μg/L和1～200μg/L，加标回收率分别为96%～108%和100%～105%，相对标准偏差小于9%和16%(n=6)，样品的检出限分别为1.0和0.3μg/L(S/N=3)。本方法简单、快速、灵敏、特异性强。【关键词】亲水液相

2、色谱三重四极杆质谱法，河豚毒素，尿液，血浆　　1引言　　河豚毒素(Tetrodotoxin,14TTX)系日本学者田原良纯1909年首先从河豚鱼中发现，目前己分离出十多种类似物，其中河豚毒素为河豚鱼的主要毒性成分（见图1）。河豚毒素是一种毒性很强的的非蛋白类神经毒素，除存在于河豚鱼体内，还广泛分布于多种脊椎动物和无脊椎动物体内。河豚毒素进入人体后可抑制神经细胞膜对Na+的通透性，从而阻断神经冲动的传导，使神经麻痹，严重者抑制呼吸从而导致死亡[1]。因此，建立快速、准确检测尿液和血浆中TTX的方法具有重要的现实意义。　　目前,TTX的检测方法主要有

3、小鼠活体生物法[2]、免疫学方法[3]、液相色谱紫外检测法[4]、气相色谱质谱联用法[5]、液相色谱柱后衍生荧光检测法[6]及液质联用法[7～9]等，这些方法多是针对河豚鱼中河豚毒素的含量测定。由于TTX的毒性极大，对于体重50kg的人，0.2mg就会引起中毒，2mg即可导致死亡，所以发生中毒时尿液和血浆中TTX的浓度很低，在μg/L数量级上，常规方法无法检出。有报道采用液相色谱柱后衍生荧光检测法[10]和液相色谱离子阱质谱联用法选择离子监测模式[11]测定中毒病人尿和血中TTX含量，方法的检出限为5μg/L；Kawatsu等[12]采用免疫

4、亲和柱净化液相色谱柱后衍生荧光法测定尿液中TTX，检出限达2μg/L,但需要制备TTX单克隆抗体；Kurono等[13]采用固相萃取结合GCMSSIM法测定血浆中TTX，检出限达0.1μg/L,但样品前处理方法复杂、费时。从方法原理上分析，气质联用法测定的是碱水解后能产生C9碱的TTX类似物的总和，而不仅仅是TTX，某些TTX类似物毒性相差较大，如4,9脱水河豚毒素的毒性约为TTX的1/500[14]；Jen等[15]采用LCMS/MS测定血清中TTX，检出限为0.1μg/L,定量限为1μg/L，但样品前处理比较复杂，需高速离心、固相萃取

5、、冷冻干燥和超滤等步骤，一次进样运行40min，TTX在死时间附近出峰。14　　本研究采用1%醋酸的乙腈沉淀蛋白，液相色谱三重四极杆质谱法测定尿液和血浆中TTX。一次进样分析仅需13min，方法快速、简单、灵敏、选择性好，适合于TTX中毒的确证分析。　　图１河豚毒素及其类似物的化学结构（略）　　Ｆig.1Chemicalstructuresofnaturallyoccurringtetrodotoxins(TTXs)　　2实验部分　　2.1仪器与试剂　　AquityUPLCQuattroPremierXE超高效液相色谱串联质谱仪配有电喷雾源(

6、美国Waters公司)，Masslynx4.1工作站；MS2旋涡混旋器(德国IKA公司)；HUP100手持式超声波细胞破碎仪(天津恒奥科技发展有限公司)；TGL16C高速台式离心机(上海安亭科学仪器厂）；GradientA10MillQ超纯水器(法国Millipore公司）。　　乙腈和甲醇(HPLC级，德国Merck公司);甲酸铵(HPLC级，Fluka公司);96%甲酸和冰醋酸(HPLC级，美国Tedia公司)；河豚毒素标准物质(纯度≥99%，大连瑞芳生化物品有限公司)，用乙腈水配制成100mg/L标准贮备溶液，保存于－35℃冰箱中。1

7、4　　2.2样品前处理方法　　吸取300μL尿液于盛有700μL1%醋酸乙腈溶液的1.5mLSafelock尖底离心管中，旋涡30s，以12000r/min离心5min，取上清液待测。　　同时在6支试管中分别按标准曲线的浓度加入适量标准溶液，加入空白尿液至1000μL，混匀，吸取300μL与样品一起处理，制作工作曲线系列。　　吸取500μL血浆于10mL试管中，加入1.5mL1%醋酸乙腈溶液，用手持式超声波细胞破碎仪均质2min,以4000r/min离心4min,吸取1.0mL上清液于10mL试管中,50℃水浴氮气吹干，加入250μL流动相

8、,超声1min,旋涡30s,上清液待测。　　同时在6支试管中分别按标准曲线的浓度加入适量标准溶液，加入空白血浆至500μL，混匀，放置3