超高效液相色谱三重四极杆质谱联用法快速检测尿液和血浆中鹅膏毒肽和鬼笔毒肽.pdf

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1、第38卷分析化学(FENXIHUAXUE)研究报告第1期2010年1月ChineseJournalofAnalyticalChemistry39～4J4超高效液相色谱三重四极杆质谱联用法快速检测尿液和血浆中鹅膏毒肽和鬼笔毒肽张秀尧蔡欣欣(温州市疾病预防控制中心，温州325001)摘要建立了同时快速检测尿液和血浆中3种鹅膏毒肽和2种鬼笔毒肽的超高效液相色谱三重四极杆质谱联用分析方法。尿液样品直接进样，血浆样品经乙腈沉淀除蛋白后，在UPLCHSST3色谱柱上分离，正离子电喷雾多反应监测(MRM)模式检测，基体P1；配标准外标法定量。尿液和血浆样品的线性范围分别为2～100和

2、1～100Ixg／L；加标回收率分别在92．0％～108．0％和85．0％～100．0％的范围内；相对标准偏差为1．0％～22．O％和2．O％～22．0％(n：6)；样品的检出限为0．2～1．0g／L和0．1～0．5I(S／N=3)。本方法灵敏，简单，快速，特异性强。关键词超高效液相色谱三重四极杆质谱法；鹅膏毒肽；鬼笔毒肽；尿液；血浆1引言毒蘑菇又称毒蕈，我国约有100种，有10多种可引起人类严重中毒。引起中毒的毒蘑菇毒素类型较多，主要有鹅膏毒肽类(Amatoxins)和鬼笔毒肽类(Phallotoxins)，它们分别属于双环八肽和双环七肽。目前，己经分离出9种鹅膏毒肽

3、，其中一鹅膏毒肽、卢一鹅膏毒肽和一鹅膏毒肽毒性大，在毒蘑菇中含量高，为引起中毒的主要毒素。鹅膏毒肽属慢性毒素，对人的致死量大约为0．1mg／kg体重，食用后至少15h后才出现中毒症状，其毒性比鬼笔毒肽强20倍。它们能强烈抑制细胞RNA聚合酶的活性，从而阻碍了蛋白质的合成，引起多种脏器细胞特别是肝、肾细胞的坏死，9～12d内死亡，死亡率高达90％。鬼笔毒肽共有7种，其中羧基二羟鬼笔毒肽和二羟鬼笔毒肽为主要毒性成分。鬼笔毒肽属速效毒素，动物静脉或腹腔注射实验，2～5h内死亡。该毒素能专一性地与细胞中肌丝蛋白(F．actin)结合，从而打破肌丝蛋白与肌球蛋白(G—actin)

4、之间聚合和解聚的动态平衡，形成大量F—actin毒肽复合体¨。蘑菇中毒，特别是鹅膏毒肽引起的中毒，中毒症状在大量细胞被损坏后才出现，因此病死率高。建立快速、准确检测尿液和血液中毒蘑菇毒素的确证检测方法，对于疑似中毒病人的尽早诊断，降低死亡率具有重要意义。目前，毒蘑菇毒素的检测多集中于鹅膏毒肽类的检测，检测方法主要有放射性免疫测定法一、毛细管区带电泳法、反相液相色谱法～和液相色谱质谱联用法”等，这些方法多针对毒蘑菇中鹅膏毒肽的含量测定。由于鹅膏毒肽的毒性较大，特别当中毒症状出现时大部分的毒素都己进入靶器官，尿液和血浆中浓度较低，常规的检测方法无法检出。Maurer等’采用

5、免疫亲和柱净化液相色谱质谱联用法测定尿液和血浆中一鹅膏毒肽和卢．鹅膏毒肽，检出限为2．5g／L。Filigenzi等H采用液相色谱．线性离子阱质谱联用法，以MS／MS／MS模式测定中毒病人血清和肝脏中一鹅膏毒肽，采用固相萃取法将样品富集4倍，一鹅膏毒肽的检出限分别为0．25ng／g和0．5ng／g。本研究采用超高效液相色谱三重四极杆质谱法同时测定了尿液和血浆中的．鹅膏毒肽、JB．鹅膏毒肽、y一鹅膏毒肽、二羟鬼笔毒肽和羧基二羟鬼笔毒肽，特别适合于毒蘑菇中毒的确证分析。一次进样分析仅需9rain。本方法灵敏，快速，简便，选择性好。2实验部分2．1仪器与试剂AquityUPL

6、C—QuattroPremierXE超高效液相色谱一串联质谱仪配有电喷雾源(美国Waters公司)，2009-04—30收稿；2009-08-20接受本文系温州市医学重点学科、温州市第j三轮“311”工程建设项目基金(No．2008012)资助}E—mail：xv~zl23@l26．corn分析化学第38卷Masslynx4．1工作站；MS2旋涡混旋器(德国IKA公司)；HUP．100手持式超声波细胞破碎仪(天津恒奥科技发展有限公司)；TDZ5一WS台式离心机(湘仪离心机仪器有限公司)；N．EVAP氮吹仪(12孔，美国Organomation公司)；2510超声波清洗机

7、(美国Branson公司)；GradientAIOMil1．Q超纯水器(法国Milli．pore公司)；针头过滤器(13mmGHP0．2txm，美国Pall公司)。乙腈和甲醇(HPLC级，德国Merck公司)；乙酸铵(HPLC级，Fluka公司)；一鹅膏毒肽(I>90％)、卢一鹅膏毒肽(／>90％)、一鹅膏毒肽(I>90％)、二羟鬼笔毒肽(I>95％)和羧基二羟鬼笔毒肽(≥9o％)均购自AlexisBiochemicals公司，用甲醇配制成100mg／L标准贮备溶液，保存于一35℃冰箱中。2．2液相色谱条件表1梯度洗脱程序ACQUITYU