使用微量红细胞比积测定观察epo在基因转移中的效果

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1、使用微量红细胞比积测定观察Epo在基因转移中的效果张晓娥1金彩科2（1珠海市第二人民医院输血科519020；2香港基因港有限公司999077）【摘要】木实验采用红细胞比积测定法观察Epo基因经直接注射及电针介导两种转移方法在小鼠骨骼肌的转移效果。结果发现，Epo基因直接注射不能引起Het的明显变化，而电针介导的Epo基因转移可导致Het的显著增高，且具有明显的量效关系。因此认为，釆用Het作为检测指标，Epo基因作为报告基因是一种简便而有效的研究基因转移的好方法。【关键词】红细胞比积促红细胞生成素基因转

2、移基因疗法【中图分类号】R459.9【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2012）35-0021-02基因疗法是一种新的疾病治疗方法，该方法的发现将会引起临床医疗及制药工业的深刻变化。目前，转基因技术的发展水平是限制该方法广泛临床应用的主要因素之一。为提高基因转移效率，人们常采用报告基因来研宄基因转移方法。常用的报告基因一般是机体木身不存在的基因，入β-半乳糖苷酶基因、荧光酶基因、氯霉素乙酰转移酶基因等。由于这些基因的表达产物多为非分泌性，不宜用来观察其全身效应。促红细胞生成素（E

3、po）时一种分泌性蛋白，其血浆浓度的改变在一定的范围内与红细胞数量高度相关[1],因而采用Epo基因作为报告基因可以观察基因转移方法的实际应用效果。我们采用微量红细胞比积测定法观察Epo基因经直接注射及电针介导两种方法在小鼠骨骼肌的转移效果，并与血浆Epo检测水平对照，获得满意效果。1、材料与方法1.1实验动物：KUNMING小鼠（20-22克），购自中山医科大学实验动物中心。1.2质粒DNA:pcD2/hEpo,具有巨细胞病毒（CMV）启动子、人Epo的cDNA的插入序列。质粒的提取制备采用离交层析法

4、[2]（QIAGEN柱：QIAGENGmbH,Germany,按说明书操作），产物经紫外、电泳、酶切及DNA序列分析，质量符合要求。1.3基因转移方法：①直接注射[3]:质粒DNA以生理盐水配成lmg/ml的溶液，按常规方法做小鼠股四头肌注射，每鼠注视50微升。对照组以生理盐水代替DNA溶液同法注射。②电针介导[4]:直接注射后，在注射部位实施电脉冲刺激。DNA注射的剂量与方法同①，注射后立即于注射刺入两根电极针，实施方波脉冲电刺激。波宽40ms，波幅80v,频率：1HZ，连续6个脉冲。电极针由两根不锈

5、钢针灸针制成，两针间距5mm,分别连接方波电脉冲刺激仪（上海教学仪器厂）的正负输出端。对照组在注射溶剂后同法给以电脉冲刺激。1.4红细胞比积（Het）测定：采用10微升定量毛细采血管，用前以1000u/ml肝素溶液湿润内壁，60°C烘干。动物切尾采血约10ul,以玻璃胶作毛细管封U,采血后约1小吋（待玻璃胶凝固），将毛细管置微量血液离心机上（上海教学仪器厂）以12000转/分离心5分钟[5],测量比积。1.5血浆EPo水平测定：采用ELISA方法测定，操作遵照试剂盒说明书（GenzymeCorporat

6、ion'USA）。2、结果2.1微量Het测定的方法精度：将同一只小鼠采血10次，测定Het，在测定10只小鼠得Het值，分别计算各组数据的均数（X）、标准差（SD）及变异系数（RSD%），结果见表1。表1微量Het测定的方法精度2.2Epo基因转移对小鼠HCt的影响：小鼠随机分成四组（直接注射对照组、电针介导对照组、直接注射基因组、电针介导基因组），每组10只。转基因后，每周测定Het,连续5周。结果见表2及图1.电针介导基因组各测得值均显著增高，以第14天为高峰，之后呈缓慢下降趋势。经t检验，该组数

7、据与苏他各组均有高度性显著差异（P值均在0.001以下）。其他各组数据之间均无显著性差异。2.3不同剂量的EPO基因转移对小鼠HCT和血浆EPO水平的影响：小鼠随机分成五组（对照组、低剂量组、中剂量组、高剂量组、最高剂量组），每组10只，其DNA用量分别为：0、10、20、40、80ug。采用电针介导的基因转移方法，转基因后第7天分别承扭HCT及血浆EPO水平。结果见图2.可见，Het及Epo均随DNA剂量的增高而增高，但当剂量高于40ug以后，Het小再增高。3、讨论本实验的主要目的在于评价将EPO基

8、因作为报告基因用于基因转移方法研究的可行性。B前常用于基因转移研究用的报告基因，如β-半乳糖苷酶基因、荧光酶基因、氯霉素乙酰转移酶基因等，其表达产物多是非分泌性的，主要用于观察培养细胞及体内局部组织的基因组转移情况，而且K基因表达产物的检测方法复杂，误差大，或者需要特殊的仪器设备。本研究的结果表明，采用微量HCT测定法观察EPO基因的体内转移效果，是一种可靠而简易的基因转移方法研究手段。该系统中，基因表达产物是EPO,血中EPO的