浅析肝癌抗原肽（epvtkaeml）与人hsp70融合基因的构建及原核表达

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1、浅析肝癌抗原肽（EPVTKAEML）与人HSP70融合基因的构建及原核表达【摘要】　　目的:构建及原核表达肝癌抗原肽（EPVTKAEML）与人热休克蛋白70（HSP70）的融合基因。方法:采用加端PCR方法,将EPVTKAEML的基因序列融合到人HSP70基因的3′端;将融合基因克隆入原核表达载体pET28a(+)中,构建重组质粒pET28a(+)/EPVTKAEMLHSP70。经限制性内切酶BamHI、XhoI双酶切鉴定及序列测定后,转化E.coliBL21（DE3）,经IPTG诱导表达融合蛋白,SDSPAGE检测表达结果。结果:应用加端PCR方法扩增出

2、约2.0kb的目的片段,序列测定结果证实,EPVTKAEML的基因序列成功地融合到人HSP70基因的3′端。经BamHI、XhoI酶切鉴定证实,融合基因成功地克隆到原核表达载体pET28a(+)上;转入重组质粒的E.coliBL21（DE3）经IPTG诱导后,SDSPAGE分析发现在相对分子质量（Mr）约72000处有表达量明显增多的蛋白条带。结论:成功地构建并表达了肝癌抗原肽（EPVTKAEML）与人HSP70的融合基因。【关键词】肝肿瘤/免疫学抗原肿瘤/遗传学表位热休克蛋白类70/遗传学基因表达　　[Abstract]AIM:Toconstructande

3、xpressafusiongeneofhumanheptomapeptide(EPVTKAEML)anheatshockprotEin70(HSP70).METHODS:AcDNAfragmentencodingEPVTKAEMLinusofhumanHSP70genebyPCRamplification.ThePCRproductsoffusiongeneidpET28a(+)/EPVTKAEMLHSP70edigestionanalysisandsequencing,andthenitedintoE.coliBL21(DE3)throughIPTGindu

4、ctiontoexpressthetargetproteinbearingHistag.RESULTS:Afragmentofabout2.0kbplifiedbyPCR.SequenceanalysisrevealedthatthesequenceofEPVTKAEMLinusofhumanHSP70.Enzymedigestionanalysisshoa/immunology;antigen;neoplasm/geics;epitope;heatshockprotein70/geics;geneexpression　　原发性肝癌是严重危害我国人民身体健康的恶

5、性疾病之一。近几十年来,尽管诊疗手段有了很大的进步,但肝癌的预后并没有得到显著改善。生物治疗是肝癌治疗的重要手段之一,尤其可能在复发转移的控制中发挥重要作用。我们应用弱酸洗脱质谱法首次从肝癌细胞系中成功分离了MAGE1编码的由HLAB7提呈的肝癌抗原肽EPVTKAEML,将其负载DC细胞,在体外及裸鼠体内均可诱导抗肝癌特异性免疫反应[1,2]。为加强EPVTKAEML的免疫原性,选择具有诱导抗肿瘤免疫作用的HSP70为载体,制备了EPVTKAEML与HSP70的融合蛋白,为进一步观察融合蛋白能否诱导产生肝癌抗原肽特异性CTL,寻求更有效的抗肝癌抗原肽疫苗奠定

6、基础。　　1材料和方法　　1.1材料菌种E.coliBL21(DE3)由本室保存。原核表达载体pET28a(+)、含HSP70基因全长片段的质粒pCDNA3.1(+)/HSP70(本校病理学教研室惠赠),B型质粒小样快速提取试剂盒和B型小量DNA片段快速胶回收试剂盒(北京博大泰克公司),PyrobestDNA聚合酶、T4连接酶、限制性内切酶(TaKaRa公司)。　　1.2方法　　1.2.1用加端PCR方法构建EPVTKAEML与HSP70的融合基因根据HSP70基因的核苷酸序列,结合引物设计的原则,设计引物,在下游引物的5′端加入EPVTKAEML的核苷酸序列(

7、共27个碱基),并在引物两端分别加入BamHI及XhoI酶切位点,引物在上海生工生物工程技术有限公司合成。上游引物:5′CGGGATCCATGGCCAAAGCCGCGGCG3′,下游引物:5′CGACTCGAGTTACAGCATTTCAGCTTTGGTAACCGGTTCATCTACCTCCTCAATGGTGGG3′。此序列中2处下划线部分分别为BamHI和XhoI,黑体（加粗）部分是肝癌抗原肽EPVTKAEML。反应条件为:94℃预变性5min,94℃变性1min,58℃退火50s,72℃延伸3min,循环1次;94℃变性1min,68℃退火及延伸3min

8、,循环28