人bax基因逆转录病毒表达载体的构建及其在hela细胞中的表达

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1、人bax基因逆转录病毒表达载体的构建及其在Hela细胞中的表达作者：陈秀军　程玉峰　王来城【摘要】　　［目的］构建带有报告基因EGFP的bax基因逆转录病毒表达载体，建立高表达bax基因的Hela细胞。［方法］通过RTPCR方法从Hela细胞克隆bax基因，根据基因工程原理，经PCR、酶切等方法构建bax基因和报告基因EGFP双基因逆转录病毒表达载体pLBaxSNIRES2EGFP，转染Hela细胞后，荧光显微镜和BI产品；兔抗人Bax一抗、羊抗兔HRP标记IgG二抗为SantaCruz公司产品；pMD18T载体为大连宝生物公司（TaKaRaDalian）产品；其它试剂购自

2、上海生物工程公司（Sangon）产品。1.2细胞培养PA317细胞以DMEM培养基培养，Hela细胞以RPMI1640培养基，置37oC、5%CO2环境下培养。培养基内含10%新生牛血清、青霉素100U/ml和链霉素100μg/ml。1.3实验技术路线如图1所示。1.4引物设计根据GenBank数据库（.ncbi.nlm.nih.gov/）得到bax基因cDNA序列（收录号：NM_138761）及其相关信息，采用Oligo6.0软件设计bax引物，序列如下：上游P15′GAGAATTCATGGACGGGTCCGGGGAG3′，下游P25′GTCTCGAGCCTCAGCCCA

3、TCTTCTTC3′，P1人为引入EcoRⅠ酶切位点，P2引入XhoⅠ酶切位点，其PCR扩增产物预计在597bp，包含bax基因整个开放阅读框（OpenReadingFrame,ORF）。另外，为了从pIRES2EGFP载体上引出IRES2EGFP基因序列，又设计了一对引物P3、P4和测序引物P5，序列如下：上游P35′GTATCTCGAGATTAAGATCTTCCGCCCCTCTCCCTCCCCCCC3′、下游P45′CGGGATCCTTTACTTGTACAGCTCGTCCAT3′、P55′ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAG3′。P3引入XhoⅠ酶切位点，P4引入

4、BamHⅠ酶切位点，扩增产物预计为1346bp。1.5bax基因克隆及鉴定采用异硫氰酸胍一步法从培养Hela细胞中提取总RNA，取1μg总RNA，按照MMLV逆转录酶操作说明书，转录成cDNA第一链，取2μl做模板，P1、P2为引物进行PCR扩增，反应体系：P1、P2各0.5μM、2.5UPfuDNA聚合酶、200μMdNTP、1×PCRBuffer，50μl反应体系；反应条件：94oC预变性10min，94oC变性30s、52oC退火45s、72oC延伸60s共35个循环，再向PCR反应管中加入1.25UTaqDNA聚合酶，72oC终末延伸15min，使扩增产物5′端加A

5、，以方便TA克隆。50μlPCR产物跑制备电泳，胶回收纯化PCR产物，按照pMD18T载体说明书进行TA克隆，转化感受态DH5α，涂布LB+Amp抗性平板，菌落PCR筛选、酶切初步鉴定阳性重组质粒pMDbax，然后用ABIBigDye3.1测序试剂盒、M13通用引物做测序PCR，在ABIPrism3100Avant遗传分析仪上做测序鉴定。1.6IRES2EGFP基因序列获得及鉴定取10ngpIRES2EGFP载体做模板，P3、P4为引物进行PCR扩增，反应体系：P3、P4各0.5μM、2.5UPfuDNA聚合酶、200μMdNTP、1×PCRBuffer，50μl反应体系；

6、反应条件：94oC预变性10min，94oC变性30s、60oC退火45s、72oC延伸90s共30个循环，再向PCR反应管中加入1.25UTaqDNA聚合酶，72oC终末延伸15min。TA克隆、阳性重组质粒筛选、测序鉴定同上，除用M13通用引物外，还用P5引物测序，将1346bp长度的DNA序列测通，将其重组质粒命名为pMDIRES2EGFP。1.7pLXSNIRES2EGFP表达载体构建及鉴定用XhoⅠ和BamHⅠ双酶切测序鉴定正确的pMDIRES2EGFP重组质粒，跑1％琼脂糖凝胶电泳，胶回收纯化1350bp左右的条带，此为两端带XhoⅠ和BamHⅠ位点的IRES2

7、EGFP基因序列。同样，用XhoⅠ和BamHⅠ双酶切pLXSN载体质粒，胶回收纯化5.9kb的线性化的载体，其两端同样带有XhoⅠ和BamHⅠ位点。用DNALigationKit将IRES2EGFP基因序列通过XhoⅠ和BamHⅠ位点定向与线性化的pLXSN载体连接，连接时其摩尔数之比控制在4:1左右。转化、筛选同上。最后XhoⅠ和BamHⅠ双酶切鉴定。此载体命名为pLXSNIRES2EGFP。1.8pLBaxSNIRES2EGFP表达载体构建及鉴定用EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切测序鉴定正确的pMDbax重组质粒，胶