浅析apoptin基因-壳聚糖缓释微球的制备及其对a375细胞的凋亡诱导作用

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1、浅析Apoptin基因/壳聚糖缓释微球的制备及其对A375细胞的凋亡诱导作用【摘要】　　目的:以羧甲基壳聚糖为基质材料,制备apoptin基因缓释微球。方法:采用复凝聚法制备apoptin/壳聚糖微球,分别用光镜观察微球形态、内切酶研究其稳定性、DNA电泳阻滞分析apoptin/壳聚糖最佳比例、PCR测定apoptin基因作为复制摸板能力、用MTT法检测其抗肿瘤活性。结果:壳聚糖与apoptin基因可形成稳定的微球,其直径在200～300nm之间,成球性较好、apoptin/壳聚糖微球P/N最佳质量比为5.5∶1、微球能够有效防止DNA酶的降解作用、apoptin/微球载体中的基因仍具有DN

2、A复制模板功能,并能有效地转染A375细胞,诱导A375细胞发生凋亡,从而抑制瘤细胞生长。结论:apoptin基因与羧甲基壳聚糖可形成稳定的缓释微球,并能有效地转染肿瘤细胞,诱导肿瘤细胞发生凋亡。【关键词】羧甲基壳聚糖基因载体细胞凋亡　　[Abstract]AIM:Toconstructthedeliverynanoparticlessystemofapoptingeneethylatedchitosan(CMC)andstudyitseffectoninducingapoptosisofhumanmelanomacellsA375invitro.METHODS:CMCnanoparticl

3、escontainingapoptingeneethod.Restrictionenzymes,DNAgelretardationassayandPCRodeleffectintheprogressofreplication.HumanmelanomacellsA375aretransientlytransformedbynanoparticlescontainingapoptingeneandapoptosiseasuredbyMTTassayatvarioustimeperiod.RESULTS:Morphologystudiesrevealedthattheparticlesooths

4、urface.Themeanparticlediameterrangedfrom200-300nm.TheratioofthechitosantoapoptinDNA(N/Pratio)DNasedegradationandcouldbeusedasthemodelintheprocessofreplication.Thenanoparticlesannerinvitroat48haftertransformation.CONCLUSION:Thechitosanvectorandapoptingenecouldbebinedtobeasafegenedeliverynanoparticle

5、ssystem,anmelanomacellsA375.　　[Key;apoptosis　　基因治疗是一种治疗人类疾病的新方法。要使基因进入缺损部位并持续作用,最重要的一点是要有基因载体,它能进入缺损细胞并与原有基因整合或持续释放表达的产物来发挥其治疗作用。目前用于基因治疗的载体有病毒性载体和非病毒性载体两大类。病毒载体由于具有选择复制缺陷性,使复制产生的病毒蛋白导致机体免疫反应,造成靶细胞损伤,转基因细胞数量减少,继而使目的基因表达的持续时间相应缩短[1,2]。病毒载体的上述致命缺陷,使人们开始将目光转向非病毒基因载体系统的研究。有人用脂质体作为基因载体,但存在的主要问题是脂质体的制备重复

6、性和储存稳定性较差,而且溶酶体可以使进入细胞的脂质体降解,这就限制了脂质体作为基因载体的应用[3,4]。羧甲基壳聚糖是一种可生物降解的高分子材料,是理想的非病毒基因载体侯选者。本实验的目的将羧甲基壳聚糖制备成携带apoptin基因微球,并将其转染人黑素瘤细胞A375,通过对细胞的转染情况进行体外检测,以探讨其作为非病毒基因载体的可能性。　　1材料和方法　　1.1材料O羧甲基壳聚糖(OCMC),青岛海洋生物研究所惠赠;脂质体（Lipofectmina）、RTPCR试剂盒、凋亡细胞DNA提取试剂盒购于Invitogen公司;所用其他化学试剂均为国产分析纯。质粒pcDNAA3是本室构建,内含

7、有肿瘤特异性凋亡基因,采用硷变性法大量提取质粒DNA,用PEG沉淀法进行纯化,所得质粒DNA含量为2g/L,纯度达到电泳纯［5］。人黑素瘤细胞A375引自军事医学科学院,本室传代保存,用含有100mL/L胎牛血清的PRMI1640培养基在50mL/LCO2、37℃传代培养。　　1.2方法　　1.2.1壳聚糖/apoptin微球的制备将浓度为0.2g/LpH6.5低分子量壳聚糖,离心,超声处理,加入K2SO4溶