金银花、连翘配伍提取物体外抗甲型流感病毒fm1株的实验研究

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1、金银花、连翘配伍提取物体外抗甲型流感病毒FM1株的实验研究流感病毒属RNA病毒类的正黏病毒科，是引起小儿上、下呼吸道感染的重要病原，流感病毒所致呼吸道感染是临床常见病、多发病，常引起地方性流行，有时可致世界性大流行[1]。现代医学迄今尚未发现理想的防治流感病毒药物，为寻找有效的抗流感病毒中药，我们选用银翘散君药金银花、连翘配伍提取物（JLT）进行抗流感病毒体外试验，为流感病毒感染的防治提供依据。1实验材料1.1实验药物及主要试剂、材料金银花、连翘饮片购买于辽宁中医药大学附属医院门诊药局，经辽宁中医药大学中药分析教研室张振秋教授鉴定为忍冬科植物忍冬的花蕾金银花和木樨

2、科植物连翘的果实连翘；利巴韦林注射液（江苏吴中实业股份有限公司，批号：060208）；甲型流感病毒鼠肺适应株A/FM1/47（H1N1），由中国预防医学科学院病毒研究所提供，冻存于辽宁中医病毒室，经鼠肺、鸡胚传代后为FM1M9E2M1E3M2E4M1E5；9日龄尼克白种鸡胚，SPF级，购买于辽宁省益康生物制品厂；1%鸡红细胞悬液：采集健康公鸡血，阿氏液抗凝，生理盐水1500r/min离心洗涤3次，弃上清液，以无菌生理盐水配制成1%悬液，4℃冷藏备用[2]。1.2主要仪器和设备全外排Ⅱ级生物安全柜（美国Baker公司，型号：SG403TXCE）；低温高速离心机（德国

3、Heraeus，型号：Biofuge28RS）；台式压力蒸汽灭菌器（沈阳盛达生物电子设备有限公司）；电热恒温培养箱（上海跃进医疗器械厂）。2实验方法2.1JLT的制备电子天平称量金银花、连翘配伍（按银翘散原方比例1∶1[3]）饮片，放入圆底烧瓶中，加入配制好的80%乙醇14倍量，电热套加热回流2h；第1次提取后倾倒滤液，药渣再加80%乙醇10倍量，加热回流1h；合并滤液，加热浓缩，水浴箱通风橱加热挥发成膏状，置于电热烘箱内烘干，研成粉末避光冷藏备用。用于体外实验时，用生理盐水配成质量浓度为400mg/mL溶液，高速离心机4000r/min离心30min，取上清,高

4、温高压灭菌后4℃冷藏备用。2.2流感病毒增毒及其在鸡胚上半数感染量的测定将病毒原液接种于局部消毒后的9日龄SPF鸡胚尿囊腔，每胚接种0.1mL，石蜡封口，33～35℃温箱孵育48h，4℃过夜。收取尿囊液，红细胞凝集试验测血凝滴度。将增毒后的流感病毒原液系列对数稀释（10-1～10-12），分别接种在事先标记好的鸡胚尿囊腔内，每种质量浓度接种4个鸡胚，并做生理盐水对照。将注射了流感病毒的鸡胚放入33～35℃温箱内，48h后取出放入4℃冰箱内过夜；收取尿囊液，每胚0.1mL依次加入作好标记的血凝板上，再加入预先配制好的1%的鸡血球0.1mL，轻摇后40min观察结果，

5、用krber公式[2]计算。测得EID50为10-6.28，实验用100EID50。2.3JLT最大不凝血质量浓度的测定中药中含有植物血凝素，在体外实验中往往引起红细胞凝集，造成假阳性结果。因此，应用血凝试验探讨中药体外直接抑制病毒作用，必须测定中药的最大不凝血质量浓度以去除影响因素。处理好的药液从原质量浓度始，用pH值7.4的Hank’s工作液2倍系列稀释6种质量浓度：2-1～2-6（400～12.5mg/mL），分别加入配制好的1%的鸡血球0.1mL，在33～35℃温箱中中和2h，测定血凝效价，同时设Hank’s液对照和病毒对照。结果测得JLT不引起血凝的最

6、大质量浓度为100mg/mL。2.4JLT及利巴韦林注射液对鸡胚最大无毒质量浓度的测定用含PS（青霉素G和链霉素混合试剂）10%的生理盐水将药物原液做连续2倍系列稀释，至1∶512，每次抽取0.2mL分别接种在预先做好标记的鸡胚上，每种质量浓度接种4个鸡胚，并设生理盐水对照。将接种好的鸡胚放入33～35℃温箱内孵育48h，每12h观察记录鸡胚存活情况，24h内死亡的鸡胚不记入药物毒性作用致死数。因JLT组自原液起未发现死亡鸡胚，故将原液400mg/mL作为药物最大无毒质量浓度。利巴韦林注射液最大无毒质量浓度为50mg/mL。2.5JLT不同质量浓度、不同时间体外直

7、接抑制病毒作用的比较研究用pH为7.4的Hank’s工作液将JLT溶液从最大不凝血质量浓度起做系列2倍稀释3种质量浓度,每种质量浓度4支试管，分别加入等量100EID50的流感病毒,置33～35℃温箱中中和1h、4h、8h、14h、16h、24h，测各组药物不同质量浓度、不同时间点血凝效价，同时设病毒对照和Hank’s液对照。2.6JLT对甲型流感病毒感染鸡胚的预防和保护作用研究2.6.1预防作用药物原液自TD0开始2倍比稀释3种质量浓度（400mg/mL、200mg/mL、100mg/mL），每胚0.1mL分别接种鸡胚，每种质量浓度的药液接种8个鸡胚，37℃孵育

8、2h，并设