桑叶提取物对小鼠感染甲型流感病毒fm1的预防与治疗作用讨论

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1、桑叶提取物对小鼠感染甲型流感病毒FM1的预防与治疗作用讨论桑是传统的药食两用植物，入药可追溯至《神农本草经》。桑叶是桑科植物桑(MorusalbaL.)的干燥叶，性寒、味甘苦，具有疏风散热、清肺润燥、清肝明目的功效。桑叶含有丰富的化学成分，具有多种药理学活性，作为单方或复方在临床上广泛应用。桑叶作为广东凉茶和夏桑菊的主要成分之一，是华南地区用于清热解毒、预防或治疗感冒及上呼吸道感染的常见药。研究表明，桑不同部位的提取物对多种病毒具有体内或体外的抗性活性，桑叶的抗流感病毒活性研究也有部分报道，但多数停留在

2、细胞水平的初步检测，其预防及治疗流感的体内检测及机制研究较少。根据已报道的提取分离方法，桑叶初提时一般分成石油醚组分、乙酸乙酯组分、正丁醇组分及水相组分4个部位，其中乙酸乙酯提取部位的主要成分包括Diels-Alder型加合物、二苯乙烯、苯并呋喃及黄酮等多酚性化合物，表现出降血压、抗病毒、抗菌、抗氧化、抗炎以及抗肿瘤等多方面生物学活性。前期研究中对广东桑不同品种桑叶的4个提取部位进行了细胞水平抗病毒活性的筛选，发现抗青10号桑叶的乙酸乙酯部位具有较好的体外抗流感病毒活性，故选择此部位进行体内实验，以期对

3、桑叶在预防和治疗流感病毒感染中的应用提供理论依据，为其抗病毒机制做更深入的研究奠定基础。　　1材料　　1.1实验动物清洁级昆明小鼠，体质量18～22g，雌雄各半，由广东省实验动物中心提供，许可证号:SCXK(粤)2008-0002。　　1.2病毒株甲型流感病毒鼠肺适应株FM1，由暨南大学医学院微生物学实验室保存，在9日龄鸡胚中增殖复壮，收集尿囊液，测定其血凝效价为1∶320，于-80℃冻存备用。　　1.3药物与主要试剂桑叶提取物:广东桑抗青10号的干燥桑叶用70%乙醇浸提3次，粗浸膏再用乙酸乙酯萃取3～

4、5次，萃取组分旋转蒸发回收溶剂，得乙酸乙酯组分5g，用二甲基亚砜(DMSO)配制成质量浓度为200mg/mL的母液于-20℃保存，用时以生理盐水稀释至所需浓度。利巴韦林(批号:国药准字H19993817)为华中药业股份有限公司产品。　　1.4RT-PCR试剂盒及引物设计TRIzolReagent购自北京康为世纪生物科技有限公司;All-in-oneTMFirst-StrandcDNASynthesisKit由广州复能基因有限公司提供;All-in-oneTMqPCRMix由广州复能基因有限公司提供。PC

5、R引物序列由英潍捷基上海贸易有限公司合成，内参照基因GAPDH正向序列:5'-CTTTGGCATTGTGGAAGGGCTC-3'，反向序列:5'-GCAGGGATGATGTTCTGGGCAG-3';目的基因HA正向序列:5'-GACCAATCCTGTCACCTCTGAC-3'，反向序列:5'-GGGCATTTGGACAAACGTCTACG-3'。　　2方法　　2.1桑叶提取物急性毒性试验24只健康昆明小鼠随机分为4组，正常对照组灌胃生理盐水

6、，3个实验组分别按2500、500、100mg/kg灌胃桑叶提取物，灌胃体积均为0.5mL/只。给药1次，当天密切观察小鼠的症状和体征，随后连续观察7d。实验结束前小鼠禁食水8h以上，称量质量后颈椎脱臼处死，解剖并观察肝脏、脾、胃、肠的组织形态。　　2.2桑叶提取物对流感病毒的治疗作用48只健康昆明小鼠随机分为6组，即正常对照组(不感染病毒，灌胃生理盐水)、模型组(感染FM1后灌胃生理盐水)、阳性药物对照组(感染FM1后灌胃利巴韦林，70mg/kg)及桑叶提取物的高、中、低剂量组(感染FM1后分别按10

7、00、500、100mg/kg灌胃桑叶提取物)。小鼠采用滴鼻法感染流感病毒FM1，滴鼻前用乙醚轻度麻醉。模型组、阳性药物对照组及各给药组以血凝效价为1∶320的FM1病毒液40μL/d连续滴鼻3d，正常对照组用等量生理盐水做相同处理。各组小鼠均在第4天开始灌胃给药，剂量为0.5mL/d，连续灌胃5d。滴鼻及灌胃期间所给食物定量(3g/只)，每天观察小鼠的症状和体征。给药完成后所有小鼠禁食水至少8h，处死取肺做相应检测。　　2.3桑叶提取物对流感病毒的预防作用动物分组及给药方法同2.2项，但改变病毒

8、滴鼻和灌胃给药的时间顺序。即各组小鼠先分别灌胃生理盐水、阳性药物或不同浓度的桑叶提取物，连续5d。从第6天开始，各组小鼠分别滴鼻给生理盐水或病毒液40μL/d，连续3d。滴鼻结束继续饲养2d，第10天处死动物做肺指数及组织病理检测。　　2.4肺指数测定治疗作用和预防作用实验中的所有小鼠处理完成后先禁食水8h以上，称量质量、摘眼球放血处死，打开胸腔取出全肺，用生理盐水洗涤两次后滤纸吸干表面水分，电子天平秤重，按下列公式计算肺指数和肺指数