肺癌可溶性抗原与树突状细胞构建肿瘤疫苗的杀伤机制体外研究

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1、肺癌可溶性抗原与树突状细胞构建肿瘤疫苗的杀伤机制体外研究关晓海,杨文凯,伊雪,李占清,邬鹏宇,张宇,陈国生【摘要】目的：通过肺癌的可溶性抗原致敏的树突状细胞（DC）激活细胞毒性T细胞(CTL)的杀伤作用各个环节的研究，初步探讨其作用机制及影响条件.方法：从健康人外周血中提取外周血单核细胞（PBMC），加入GMCSF和IL4后，在第4日加入不同的促成熟因子，观察DC的表型变化及测定上清中的细胞因子情况.通过DC表面HLADR的表达来比较不同抗原致敏DC的优劣.应用不同浓度的肿瘤可溶性抗原（T

2、SA），DC负载TSA的不同时间，不同活化时间的CTL及不同TAK与GLC82细胞的效靶比来测定其中各种引起TAK最高杀伤活力的情况.结果：DC较好的促成熟因子是MCM，第7日时达到高峰；TSA是较好的致敏DC抗原；最佳效靶比为1∶50.结论：肺癌可溶性抗原是良好的DC致敏物，可在单核细胞条件培养基（MCM）协助下致敏并使DC成熟，表达更多的HLADR，高效激活T细胞.【关键词】树突状细胞　　0引言　　肿瘤的主动免疫治疗一直是肿瘤治疗研究的热点.树突状细胞(DC)是摄取、加工、呈递抗原的重要

3、专职抗原呈递细胞，它呈递抗原的能力最强.对如何在体内外通过刺激扩增和激活DC，提高其抗原递呈功能，以诱导特异性的细胞免疫反应等一系列以DC为手段的抗肿瘤免疫成为近年来的一大研究热点.本实验就其各个环节的作用及机制作一初步探讨.　　1材料和方法　　1.1材料　　1.1.1主要试剂hGMCSF，hIL2，CD80McAb，CD56McAb，CE14McAb抗人CD3McAb（北京邦定公司）hIL4，hTNFα（美国PEPROTECH公司）鼠抗人CD1McAb，鼠抗人HLADR（北

4、京中山公司）羊抗鼠IgG抗体（SautaCruzBioTech公司）T淋巴细胞检测试剂盒(SAP法)，IL12,IL2,TNFα,IFNγ,ELISA检测试剂盒（美国ZYMED公司）.　　1.2方法　　1.2.1单核细胞条件培养基（MCM）的制备将直径100mm的塑料培养皿在人丙种球蛋白（10g/L）室温下包被备用.取健康成人新鲜外周血经淋巴细胞分离液（FICOLL）密度梯度离心得到PBMC，调细胞密度为2×1010/L悬于完全培养基中，37℃,50mL/LCO2孵育2h，洗去非黏附细

5、胞，继续孵育24h，收集培养上清即单核细胞培养基，经过滤、除菌于-20℃保存.　　1.2.2人外周血DC的体外初步诱导取健康成人外周抗凝全血50mL，Ficoll法获取PBMC,调细胞密度为3×109/L，除去悬浮细胞及非贴壁细胞，加入终浓度为100ng/mL的hGMCSF，50ng/mL的IL4及含10g/LFBSEPMI1640完全培养基1mL，隔日换液并保持细胞因子浓度不变，以备下一步实验使用.　　1.2.3DC成熟实验于DC培养第4日，将TSAⅡ以终浓度50ng/mL加入DC中培养，

6、在培养第5日后得到的未成熟DC取其中4组，分别加入不同的促成熟因子：MCM（按体积比1∶3）、TSAⅡ（终浓度为20mg/L）,TNFα(100μg/L),对照组按照原浓度加入GMCSF和IL4培养，于孵箱培养48h后分别收获DC细胞.　　1.2.4肿瘤抗原的提取1∶3摩尔氯化钾(3mmoL/LKCl)法和酸洗涤法提取人肺癌GLC82细胞的表面可溶性抗原多肽.　　1.2.5三种抗原成分致敏DC上述三种抗原成分分别加入培养4d得到的未成熟树突状细胞中，TSAⅠ组，TSAⅡ组，酸洗涤抗原组，

7、未加抗原对照组4组，置于37℃，50mL/LCO2孵箱中孵育4~6h冲击致敏，然后于含单核细胞条件培养基和GMCSF和IL4的全培中继续培养72h后分别收集细胞，每组细胞分别做HLADR法检测（用SABC法）抗原呈递分子表达变化.　　1.2.6致敏DC诱导特异性CTL的不同活化时间对TAK细胞杀瘤活性的影响将SAⅡ致敏的DC与T细胞按1∶20混合培养9d，分别于第1,3,5,7,9日收集TAK作为不同活化时间的效应细胞，分别再与靶细胞人肺腺癌GLC82细胞按50∶1混合置于96孔培养板孵

8、育12h，每孔设3个复孔，同时设单独T细胞与单独靶细胞的对照组.用MTT法测定杀伤率.　　统计学处理:数据用x±s表示，采用SAS6.0软件进行方差分析检验，多重比较采用SNKq检验.　　2结果　　2.1DC免疫分子表型的变化SABC免疫组化法检测各组DC免疫分子的表达情况见表1.MCM组对DC表型的影响更为明显，与其它组相比，差异具有统计学意义（P均小于0.05）,说明MCM促进DC成熟的能力极强.　　表1不同促成熟因子对DC免疫分子表达的影响(略)　　2.2肿瘤抗原致敏DC的抗原呈递分子表