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1、反相HPLC法测定大鼠组织中异钩藤碱含量论文.freelm×250mm,5μm)为固定相,前置保护柱为ethodThetissuesampleethanol,.freelethanol,thendetectedbyRP-HPLCdirectly.m×250mm,5μm)andpre-columnm×10mm,5μm)ineobilephaseL/min.The.ResultsThestandardcurveofIsorhynchophyllineconcentratoninrattissues：Y＝48.558
2、X＋0.2076(n＝6),r＝0.9996,itappearsagoodlinearrelationshipL.Theaveragerecoveryofehodissensitive,rapid,simple,specificandreproducible.Keyination；HPLC异钩藤碱(Isorhynchophylline,Isorhy)系中药钩藤的主要生物碱之一,具有降低血压及明显负性变时等效应,与扩血管药配伍使用时,可增强降压作用,同时可克服扩血管药加快心率的不良反应1-2。本试验采用反相HPL
3、C法测定大鼠组织中异钩藤碱的含量,为后期研究异钩藤碱在大鼠组织内的分布,继而对钩藤的归经理论研究奠定基础。1仪器与试药日本岛津LC-20A高效液相色谱仪,包括LC-20AD高压泵工作站,SPD-20A紫外检测器,浙江大学N2000色谱数据处理机,恒温箱。异钩藤碱对照品购于南昌贝塔生物科技有限公司,批号10525-080117,纯度98%以上。钩藤购于成都市新荷花饮片公司,经西南交通大学生命科学与工程学院药学系宋良科教授鉴定为2005年版《中华人民共和国药典》(一部)规定入药的钩藤。内标物卡马西平购自中国药品生物
4、制品检定所,批号100141-199503。甲醇为色谱纯,三乙胺等其他试剂均为分析纯。2方法与结果2.1色谱条件色谱柱为m×250mm,5μm),前置保护柱为m×10mm,5μm)。流动相：甲醇-水(70∶30)含0.03%的三乙胺,流速：0.8mL/min,检测波长：λ＝254nm。2.2对照品和内标储备溶液的配制精密称取异钩藤碱2.0mg、内标卡马西平2.5mg,分别置于10mL容量瓶中,加甲醇至刻度线,得到浓度为200μg/mL的异钩藤碱对照品储备液和浓度为250μg/mL的卡马西平内标储备液。2.3样品
5、制备L),剂量为含原药材1.25g/kg,连续灌胃3d,第3日灌胃2h后断头处死,取其肝、肾组织,生理盐水洗净,3层滤纸吸干,称取一定量用生理盐水制成L,置于2mL的干燥离心管中,加入100μL的内标储备液,加2mL甲醇,涡旋混匀30s,静置沉淀2h,取出,3500r/min离心7min,取上清液于干燥的离心管中,氮气流吹干,甲醇500μL复溶2h,10000r/min离心5min,取上清液20μL进样检测。2.4专属性试验按照“2.3”项下方法制备空白组织溶液、含异钩藤碱的供试品溶液。分别精密吸取空白组织溶液
6、、含异钩藤碱的供试品溶液、对照品溶液20μL进样并测定,色谱图见图1。结果表明,阴性样品色谱图中对照品峰相应保留时间处未见色谱峰。2.5线性关系考察于空白组织匀浆中加入不同量的异钩藤碱对照品储备液(200μg/mL的甲醇液),配成系列浓度0.16、0.8、1.6、4.0、8.0、16μg/mL,按照“2.3”项下方法进行处理后,分别取20μL进样测定。以组分与内标的信号比对组分浓度做标准曲线,求得回归方程为：Y＝48.558X＋0.2076(n＝6),r＝0.9996(X为异钩藤碱峰面积与内标峰面积之比,Y为异
7、钩藤碱浓度),在0.16～16.0μg/mL范围内线性关系良好。2.6大鼠组织中异钩藤碱含量的测定(见表1、表2)表1肝组织中异钩藤碱的含量，表2肾组织中异钩藤碱的含量（略）2.7精密度试验(见表3)准确配制浓度为0.16、1.6、16μg/mL异钩藤碱组织匀浆液各3管,1日内经上述组织样品处理方法处理后进行测定,计算日内精密度。不同日内测定,求得日间精密度。表3精密度试验结果(略)2.8加样回收率试验(见表4)取已测异钩藤碱含量的组织样品9份,分3组,每份0.5mL,分别加入异钩藤碱对照品储备液(浓度为200
8、μg/mL)1、5、25μL,然后按照“2.3”项下方法进行处理后,分别取20μL进样测定。表4加样回收率试验结果(略)3讨论在已有的相关文献报道中,对异钩藤碱的体外和体内检测方法的流动相主要是甲醇-水(95∶5)3、甲醇-水(75∶25)4、甲醇-水(55∶45)5,含0.01mol/L三乙胺,冰醋酸调pH7.5。本试验根据需要采用内标法测定,故而在文献资料所涉及流动相的基础上,从9
