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1、不同类型的DNA聚合酶β基因对CHO细胞的影响论文赵继敏，金戈，黄幼田，杨洪艳，郑智敏，董子明【关键词】流式细胞术EffectofutantDNApolymeraseβexpressiononCHOcellsgroeraseβ(DNApolβ)ofutant（58bpdeletion）onChinesehamsterovarycells(CHO).METHODS:TheexpressionofmRNAofutantintransfectantcellsinedbyRTPCRandthegroetry.RESUL
2、TS:CelllinesstablyexpressingutationalpolβutantgeneeongroutanthavedifferenteffectonCHOcells.【Keyetry【摘要】目的：比较野生型和突变型（58bp缺失）DNA聚合酶β(polβ)基因对真核细胞生长特性的影响.方法：将表达人野生型和缺失型DNApolβ的中国仓鼠卵巢细胞株（CHO），用RTPCR方法鉴定野生型和缺失型DNApolβmRNA水平的表达，MTT法测生长曲线、流式细胞术测细胞周期.结果：转染野生型和突变型DNA
3、polβ的CHO细胞株中.freelRNA水平的表达;转染突变型（58bp缺失）polβ基因的细胞增殖速度和S期比例增高均高于未转染组细胞，差异有统计学意义(P0.05).而转染野生型polβ基因对细胞增殖速度和细胞周期无明显影响（P0.05）.结论：高表达外源性野生型和突变型DNApolβ，对CHO细胞生长具有不同的影响.【关键词】DNApolβ;转染;CHO细胞;RTPCR;流式细胞术0引言碱基切除修复（baseexcisionrepaire,BER）是清除细胞内DNA损伤的主要途径，DNA聚合酶β（DNA
4、polymeraseβ，DNApolβ）是BER过程中的关键酶.研究polβ基因的突变及功能异常在肿瘤发生发展中的作用，对进一步阐明肿瘤的分子发病机制,对肿瘤的基因治疗有重要意义.我们将不同类型的polβ的真核表达载体转染哺乳动物细胞，观察野生型和突变型polβ基因的表达对细胞生物学特性的影响如下.1材料和方法1.1材料中国仓鼠卵巢细胞(Chinesehamsterovarycells,CHO)由陈萍萍博士惠赠,DMEM培养基为Hyclone公司产品,Trizol总RNA提取试剂盒为Gibco公司产品.CHO细
5、胞用含100mL/L胎牛血清的DMEM培养基、50mL/LCO2,37℃,饱和湿润空气中培养.1.2方法1.2.1表达产物的mRNA水平的鉴定按Trizol试剂盒操作说明，分别提取野生型和突变型polβ转染和空载体转染的CHO细胞及未转染CHO细胞总RNA.紫外分光光度计测定其浓度.逆转录反应体系总体积为30μL,反应体系中含1mmol/LdNTP,2.5μmol/L随机引物，166.7nkatRNA酶抑制剂，250.05nkatAMV逆转录酶，1×逆转录反应缓冲液积5mmol/LMgCl2,取总RNA2μg.
6、逆转录反应条件为42℃60min,95℃变性5min.当鉴定目的基因在mRNA水平的表达时，RTPCR中我们采用了特异性较强的引物，利用质粒中T7启动子为特异性的上游引物序列，polβ特异引物为下游引物序列，来证实转染细胞中外源基因的存在.上游引物为5′TAATACGACTCACTATAGGGAGA3′，下游引物为5′ACTCGTATCATCCTGCCGAA3′，野生型和突变型polβ扩增片断大小分别为312bp和254bp,而未转染CHO细胞及转染空质粒细胞无相应片断.PCR反应总体积为30μL,.freel
7、mol/LMgCl2,10×PCR缓冲液3μL,200μmol/LdNTP,上下游引物各0.25μmol/L,Taq酶8.335U,逆转录产物5μL.PCR反应条件：94℃预变性5min，94℃变性50s，54℃退火50s，72℃延伸50s，30个循环后，72℃延伸7min.取两种转染细胞和转染空载体及未转染CHO细胞的RTPCR产物各5μL，与上样缓冲液混合后进行15g/L琼脂糖电泳.1.2.2检测CHO的生长曲线和细胞周期取野生型polβ转染组对数生长期（CHOPTT20μL/孔，继续培养4h.小心吸除孔中
8、的培养液，加入酸化异丙醇200μL/孔，在水平摇床上振摇10min,至紫色颗粒完全溶解.在酶标仪上490nm处测每孔的A并求出平均值.连续测6d.以时间为横坐标，A值为纵坐标，绘生长曲线.同法、同时接种缺失型polβ转染组（CHOPM）,空载体转染组细胞（CHOneor，neor基因是载体pcDNA3.1中的标记基因，具有氨基糖苷抗生素G418抗性）和未转染组CHO细胞，测A值、绘生长
