DNA聚合酶含量对目的基因扩增的影响.pdf

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1、陕西医学杂志2013年2月第42卷第2期155[7]KitamuraY，Ninomiya．Smadexpressionofhepaticstel—expressioninhumanGFAP—negativelaminacribrosacellslatecellsinlivercirrhosisinvivoandhepaticstellatecell[J]．Glia，2005，52(4)：309—324．lineinvitro[J]．PatholInt，2003，53(1)：18—26．[9]GressnerAM，

2、WeiskirchenR，BreitkopFk，eta1．Rolesof[8]KirwanRP，LeonardMO，MurphyM，eta1．TransformingTGF-betainhepaticfibrosis[J]．FrontBiosci，2002，7(1)：_growthfactor-beta-regulatedgenetranscriptionandprotein793—807．(收稿：2012—09—25)DNA聚合酶含量对目的基因扩增的影响陕西中医学院第二附属医院(成阳712000)李宏田亚宁董昌

3、虎梁漫王蕾齐婧仝航斌周智辉▲摘要目的：探讨DNA聚合酶在PCR技术检测目的基因时的最佳作用浓度及DNA聚合酶浓度对目的基因片断扩增结果的影响。方法：其他反应条件不变的前提下，分别固定TaqDNA聚合酶含量和Mg抖浓度进行PCR反应，然后通过琼脂糖凝胶电泳检测得出二者最佳作用浓度。结果：在5Ol的PCR反应体系q-，用0．5tA的TaqDNA聚合酶(5u／,1)和2tA的25mMMgC1z进行PcR反应时，目的基因扩增产物质量相对完好，电泳检测条带清晰规整。结论：DNA聚合酶含量对目的基因片断的扩增结果影响巨大。主

4、题词聚合酶链反应容积渗克分子浓度基因扩增【中图分类号】R394．2【文献标识码】A【文章编号】1000—7377(2013)02—0155—02目前，随着分子生物学技术的快速发展，PCR技10min，弃上清收集细胞。加入lml红细胞裂解液，混术广泛应用于医学研究领域，除在科研方面的贡献巨匀，冰中静置10min。5000rpm10min，弃上清收集细大之外，对于临床疾病的诊断和预后评估方面具有重胞。重复前两步，直到沉淀中肉眼可见之红色。用要的应用价值。本文着重从PCR反应体系的1个关15Ol的白细胞裂解(含10mM

5、Tris—C1PH-8．0，键因素：TaqDNA聚合酶含量进行实验研究，寻求最100mMNaCl，10mMEDTA，0．5SDS，0．1mg／ml蛋佳的TaqDNA聚合酶PCR反应条件。TaqDNA聚白酶K)液悬浮沉淀，置于37℃水浴中过夜。加入等合酶是Mg依赖性酶，因而对Mg抖的浓度最为敏体积的饱和酚，充分混匀，以12000r／min离心10min，感，在PCR反应中耐热DNA聚合酶的活性与反应体将上清液移至另一EP管中。加入等体积的氯仿：异系中游离Mg浓度直接相关，反应体系中Mg。浓度戊醇(24：1)l_】]

6、，充分混匀，以12000r／min离心低时，酶的活力显著降低；过高时，酶则催化非特异性10min。去上层水相，加入1／10体积的3MNaAC，2扩增。因此，在固定其他因素的前提下，探讨两者最佳倍体积的冰乙醇，{昆匀后放置在一2O℃静置1h。以作用浓度，从而提高TaqDNA聚合酶的作用效力，以12000r／min离心10min，小心弃上清。7O的乙醇洗获得理想的目的基因的扩增片断。涤两次，以12000r／min离心5min，弃上清，室温干燥材料与方法15min。TE缓冲液溶解DNA，使其A：260／280的比1材料

7、实验标本：收集5O份正常人的静脉值界于1．65～1．80之间，一20℃保存待用。②PCR血，EDTA抗凝。主要仪器及设备：低温冰箱、低温超速反应体系的设立及PCR扩增：PCR反应体系总体积离心机、PCR扩增仪、凝胶成像系统。主要试剂：Taq固定在常用的5O“l，DNA模板采用同一个样本(浓DNA聚合酶(MBI)，Marker(100bp-1500bp，广州东胜)，度：50ng／tA)11，10×Taqbuffer：5tA，10mMdNTP：25mMMgC12(MBI)，琼脂糖(SpanishSpecificati

8、ons)。1肚l，上下游引物各l／A(浓度为：50t~mol／L)，引物使用2方法①DNA的提取：采用经典的酚一氯HLA微卫星引物：MIB(位于：HLA—B基因着丝粒点25Kb处)，上游引物序列：MIB一1：5CTACCATGA仿一异戊醇法：在室温下融化血液，混匀后吸取0．6ml至离心管中，加入3～5倍体积的红细胞裂解液(含CCCCCTTCCCC3，下游引物序列：MIB一