胆碱对h2o2诱导的心肌细胞凋亡的保护作用论文

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1、胆碱对H2O2诱导的心肌细胞凋亡的保护作用论文李丽于宏伟刘春凤金龙云【摘要】目的探讨M3受体激动对H2O2诱导的大鼠培养心肌细胞凋亡的作用。方法以H2O2诱导大鼠培养心肌细胞损伤模型为基础，给予M3受体激动剂胆碱和M3受体阻断剂4DAMP进行干预。流式细胞仪检测细胞凋亡;RTPCR检测凋亡抑制蛋白Bcl2。结果①胆碱可显著降低H2O2对心肌细胞的损伤，提高心肌细胞存活率，并降低细胞的凋亡率;②胆碱可增加凋亡心肌细胞Bcl2的表达;③M3受体阻断剂4DAMP可逆转胆碱的上述作用(P0.01)。结论激动M3受体对H2O2诱导的心肌细胞凋亡有保护作用，其机制可能与凋亡抑制蛋白Bcl2有关。

2、【关键词】M3受体;心肌细胞凋亡;过氧化氢;流式细胞仪;反转录聚合酶链式反应心脏在缺氧、酸化、钙超载等病理条件下，心肌细胞内生存信号因子减少,死亡信号因子增加,导致心肌缺血损伤，从而引起严重的心律失常。因此，目前认为能够有效地改善心肌损伤是治疗某些致死性心律失常的根本方法。胆碱具有许多生物活性,在心血管系统中,通过激动心脏M3受体产生负性频率和负性肌力作用,对离体大鼠心肌缺血/再灌注损伤的作用及机制已有较明确的研究〔1～5〕.freela公司)，4DAMP加拿大蒙特利尔实验中心提供，胰蛋白酶(Sigma公司),优级胎牛血清(中国医学科学院生物工程研究所，北京灏洋生物公司),培养液(Gibco

3、公司),AnnexinⅤ/PI细胞凋亡试剂盒(北京宝赛生物技术有限公司)，RNA总提取试剂盒(Promega公司)，RT试剂盒(Promega公司)，PCR扩增试剂盒(Promega公司)1.3心肌细胞原代培养取1～3d龄的P组:将胆碱和4DAMP处理心肌细胞10min后,加入H2O2(200μmol/L)与心肌细胞共育4h。1.5细胞凋亡率检测6孔板培养的细胞药物处理,0.125%胰酶消化,预冷的PBS洗3次,BindingBuffer重悬细胞,200目筛网过筛,调整细胞浓度为1×106个/ml。检测前30min加入FITCAnnexinⅤ,低温避光孵育,检测前5min加入碘化丙啶。用流

4、式细胞仪(DB公司FACSCALibur)检测细胞凋亡率。1.6RTPCR反应1.6.1总RNA提取利用TrizolReagent总RNA提取试剂盒，按照说明书的要求操作，并用RNasefree的DNaseⅠ(Promega，Madison,arker进行对照。1.6.3结果检测将凝胶置于TanonGIS系列数码凝胶图像处理系统中，照相并扫描，利用TanonGSIID图像分析软件(Ver.3.73)分析确定各特异核酸条带的灰度值。1.7统计学处理数据以x±s表表示，采用组间t检验。2结果2.1流式细胞仪检测细胞凋亡正常组仅有极少量凋亡细胞(1.81±3.88)%。表明正常心肌有少量细胞凋

5、亡，H2O2组可见较多凋亡细胞〔(29.54±38.32)%〕，较正常组明显增多(P0.01);胆碱+H2O2组可见散在凋亡细胞〔(12.14±8.48)%〕，较H2O2组明显减少(P0.01);4DAMP+胆碱+H2O2组仍可见到较多凋亡细胞〔(21.67±11.74)%〕，较胆碱组高(P0.01)。提示胆碱可降低H2O2诱导的心肌细胞凋亡，而4DAMP取消了胆碱对心肌细胞的保护作用。2.2H2O2诱导心肌细胞凋亡后抗凋亡基因Bcl2mRNA的表达在RTPCR的结果中发现，与对照组相比,H2O2组Bcl2mRNA表达明显减少(P0.01);与H2O2组相比,加入胆碱后Bcl2mRN

6、A表达又增加(P0.01);胆碱+4DAMP+H2O2组Bcl2mRNA表达减少。表明激动M3受体可以改善Bcl2mRNA水平。见图1。3讨论神经递质受体和离子通道是心肌细胞膜上两大类极其重要的蛋白质，其功能失常是许多心脏疾病发生的原因。目前的研究表明，心脏M3受体具有重要的生理功能和病理意义,可以通过介导一种新型的钾电流(IKm),改善细胞间电信号传导，以及发挥心肌保护作用〔3〕。并且，心脏M3受体在众多心脏疾病(如缺血性心律失常、房颤、充血性心力衰竭等)的发生发展中发挥重要的作用。Bcl2基因位于染色体18q21,Bcl2蛋白位于线粒体内膜、核周边及内质网上〔8〕。过去认为Bcl

7、2系抑制抗癌蛋白，但近年来研究提示Bcl2基因并不促进细胞的分裂，而是促进细胞的生存，抑制细胞的凋亡，其生理功能是防止细胞的衰老，因而与细胞的存活有关〔9〕。若Bcl2过度表达，则可使细胞凋亡减少。转染后的T、B淋巴细胞存活力明显增强，正常组织中寿命长的细胞基因表达水平也较高。最新研究发现细胞凋亡需要多种蛋白酶的活化，而Bcl2具有蛋白酶抑制剂的功能，可见Bcl2抑制细胞凋亡的机制是多方面的。本实验