波动性高糖对大鼠肾小球系膜细胞氧化应激的影响论文

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1、波动性高糖对大鼠肾小球系膜细胞氧化应激的影响论文田晓玲，郑景晨，章海凌，沈飞霞，刘芳【摘要】目的:对比研究波动性与稳定性高糖对肾小球系膜细胞（GMC）氧化应激的影响。方法:体外培养大鼠肾小球系膜细胞株，分正常糖对照组(5.5mmol/L，NG)、稳定高糖组(25mmol/L,HG)、波动性高糖组（5.5mmol/L或25mmol/L，每24h交替.freelittentandconstanthighglucoseonoxidativestressinculturedRatGlomerularMesangialCells（GMC）.Methods:GMCa

2、lglucosecontrolgroup（5.5mmol/lglucose，NG），highglucosegroup（25mmol/lglucose，HG）andintermittenthighglucosegroup（5.5mmol/lalternatingmol/lglucoseonadailybasis，IHG）invitrofor6days.2’，7’-dichlorofluoresceindiacetate（DCFH-DA）etry，andthelevelofROSeasured．Theactivityoftotalsuperoxidedism

3、utase（T-SOD）andthelevelsofma1ondialdehyde（MDA），glutathione（GSH）insupernatantatometry.Results:paredittenthighglucosecausesamoresignificantdamageforoxidativestresstoGMC.Keyittenthighglucose；glomerularmesangialcell；oxidativestress高血糖在包括糖尿病肾病在内的多种并发症的发生、发展过程中起重要作用。高血糖引起的体内活性氧簇（ROS)的改

4、变可能是引起糖尿病肾病的重要原因之一。糖尿病患者高血糖有两种表现：慢性稳定性高血糖与慢性波动性高血糖1。高血糖及血糖波动幅度增大均是糖代谢紊乱加重的征象2，3。临床研究发现，旨在控制波动性高血糖的胰岛素强化治疗可明显降低糖尿病患者慢性并发症的发生4，提示波动性高血糖可能在糖尿病慢性并发症的发生中有着极其重要的病理学意义。本研究旨在观察波动性与稳定性高糖环境对肾小球系膜细胞内ROS的产生是否有不同影响，以揭示糖尿病肾病发生的可能机制。1材料和方法1.1材料1.1.1细胞株和试剂：大鼠肾小球系膜细胞株购自上海长征医院；正常葡萄糖（含5.5mmol/LD-葡萄

5、糖）及高糖（含25mmol/LD-葡萄糖）DMEM培养液购自美国Gibco公司；胎牛血清（FCS）购自天津正江高科技有限公司；二氢二氯荧光素（DCFH-DA）购自Sigma公司。超氧化物歧化酶（SOD）、还氧型谷胱甘肽（GSH）、脂质过氧化物（MDA）测定试剂盒购自南京建成生物工程公司。1.1.2主要仪器：二氧化碳培养箱（Cellstar，美国)，FACScalibur流式细胞仪（BectonDickison，美国），紫外分光光度仪（BackmanDU460，美国)。1.2方法1.2.1细胞培养：大鼠肾小球系膜细胞株购自上海长征医院肾内科，常规培养于含1

6、0%FCS的DMEM培养液中，每周传代2～3次。1.2.2实验分组与处理：取对数生长期GMC，按每孔约3×104个接种于6孔培养板中，待细胞贴壁后，吸去原有DMEM培养液，换为1%FCS培养液，培养24h使所有细胞的生长同步化。按下列分组进行处理：①对照组（NG）：稳定正常糖浓度（5.5mmol/L)DMEM培养液；②稳定高糖组（HG）：稳定高糖浓度（25mmol/L）DMEM培养液；③波动高糖组（IHG）：5.5mmol/L与25mmol/L培养液24h轮替。在37℃，5%CO2条件下培养6d，每孔细胞均为每24h换液一次，然后收集全部条件培养液，离心

7、，取上清液于-70℃保存备检测。1.3ROS捕获及流式细胞仪检测用0.25%胰蛋白酶消化并离心收集上述贴壁细胞，细胞收集好后悬浮于无血清培养液稀释好的10μmol/LDCFH-DA中，使细胞浓度为（1×106～2×107）/ml，37℃细胞培养箱内孵育20min。每隔3～5min颠倒混匀一下，使探针和细胞充分接触，用无血清细胞培养液洗涤细胞三次，立即在流式细胞仪上检测ROS水平，激发光为氩离子激光488nm谱线，每个样品测定10000个活细胞，检测各组细胞内二氯荧光黄（dichlorofluorescin，DCF)的荧光强度。1.4上清液总SOD活力、G

8、SH及MDA含量的测定将上述收集的细胞上清液，按试剂盒说明书进行检测。1.5统计