一个新的冷诱导茶树cbf基因的克隆与功能分析

《一个新的冷诱导茶树cbf基因的克隆与功能分析》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。

　　一个新的冷诱导茶树CBF基因的克隆与功能分析第1章引言1.1参与植物非生物胁迫应答的主要转录因子的研究概述植物的非生物胁迫是在干早、低温、高盐这些较极端的外界环境下，植物的生长发育受到很大的迫害，对植物的生长造成的恶劣影响。非生物胁迫已经成为全球农业减产的主要因素。据统计，在世界范围内，每年造成农作物产量损失50%的因素与非生物胁迫有密切相关。蹄选、鉴定植物抗逆相关基因，阐述植物抵御非生物胁迫调控机制具有重要意义。因此，研究植物抵御非生物胁迫的转录因子，对其转录活性和功能结构进行分析，对植物的生长发育及农作物的增值增产、提高经济效益具有重要意义。转录因子(transcriptionfactor,TF),又称反式作用因子，是能够与基因启动子区域中的顺式作用元件，发生特异性作用的DNA结合蛋白。通过与反式作用元件间的相互作用，以及与其他相关蛋白间的相互作用，激活或抑制基因的转录。转录因子的一般结构包括：（1) DNA结合结构域（DNA-bindingdomdn)能够特异性地识别顺式作用元件并与之结合的保守的氨基酸残基序列。'这些氨基酸残基具有高度的保守性，若被换成其他氨基酸残基，就会失去与顺式元件的结合能力。（2)转录调控结构域（Transcriptionregulationdomain)包括转录激活域结构域(transcriptionactivationdomain)和转录抑制结构域两种。典型的植物激活结构域是与DNA结合结构域分开的，一般由30?100个氣基酸残基组成，有富含酸性氛基酸、脯氛酸、丝氨酸和苏氨酸这4种特征。转录因子可以通过这些结构域与其他蛋白相互作用（3)寡聚化位点（Oligomerizationsite)转录因子可在寡聚化位点区发挥相互作用，其氮基酸序列也是高度保守的，一个功能性结构域。转录因子之间可在此区相互作用成同源、异源聚合体，对DNA结合能力、DNA结合的特异性和细胞的核定位造成影响。（4)核定位信号区（Nuclearlocalizationsignals)是转录因子中富含精氨酸和赖氨酸残基的区域。转录因子与其他种类的蛋白一样，在细?胞质合成，但转录过程却发生在细胞核，因此是由核定位信号选择性的将转录因子从细胞质转运到细胞核中，转录因子进而才能发挥其转录调节作用[7]。转录因子进入细胞核通过一个或数个核定位信号进行，而没有有核定位信号的通过与含有核定位信号的转录因子间的相互作用进入细胞核中。.. 1.2植物抗寒及相关转录因子CBF的研究概况冷害和冻害是造成农作物减产的主要因素，影响全球农业的发展。冷害会影响植物生长发育，外界气温处于零度以上，不至于引起细胞内部结成冰晶。冻害是零度以下的低温造成植物细胞内部结冰，从而造成细胞脱水，甚至死亡。冷驯化是植物为适应外界的低温环境，逐渐增强了自身抗寒抗冻能力，形成的一种自身保护机制《当植物经过适应性的低温处理后，及而具有更强的抗寒抗冻能力。在冷驯化过程中，植物细胞内部物质发生多种变化，如糖类、不饱和脂肪酸和蛋白等物质含量的变化，使细胞增加了低温保护剂，因此，抗寒能力提高。近年来，科学家从多种植物中克隆出冷胁迫响应基因，如CBF类基因，属于AP2家族的转录因子。第2章茶树C5F基因组全长的克隆 因前，茶树功能基因组序列还未测出，所以与低温胁迫相关基因只能通过两种常用方法获得：（l)SSH，AFUP这些大批量的基因蹄选技术，缺点是随机性大，目的性低，分离得到的片段的背景不清楚，信息不完善。研究茶树抗寒性时，若对片段逐-?进行功能鉴定，难度很大；（2)可针对拟南芥等模式植物在抗寒研究中已获得的基因，选取研究较为透彻的，在茶树中进行同源性克隆，这样很有针对性，并且迸行功能鉴定后，就可直接用于改善茶树抗寒性。利用RT-PCR和RACE技术，获得了一个茶树冷诱导CBF基因的cDNA片段，命Z%Cs-COR041。本实验根据已知茶树Csa)/?6ARTcDNA文库为模板，以基因特异性引物和通用引物结合扩増茶树cDNA的3末端和5末端，将已知的COR041cDNA序列与所得的5端及3端序列拼接得到基因全长。然后分别在5非翻译区和3非翻译区设计茶树抗冻基因厂？全长的引物，扩增得到基因全长。.2,1试验材料2.1.1植物材料信阳茶树群体种。2.1.2质粒与菌株pGEM-T克隆载体（购自Promega公司）、DH5a大肠杆菌菌株。2.1.3主要试验器材分析 天平（OHAUS);pH计（LIDAPHS-3C)；灭菌锅（SHENANLDZM-60KCS)；纯水仪（M1LLIP0RESimplicity185)；恒温水浴锅（精宏XMTD-8222)；制冰机(SANYOSIM-F124)：PCR扩增仪（AppliedBiosystems2720ThermalCycler)；高速冷冻离心机(EppendofCentrifiige581OR)；台式离心机(ThermoPico17);电泳仪（DYY-6C);凝胶成像仪（ChampGel5500);-80°C超低温冰箱(SANYOULTRALOCsCBFJ转入烟草，获得转基因植株；纯化CBFI和CBF3蛋白。具体试验结果如下：笫一，基因全长为1162bp。将其提交到GenBank，获取基因登录号KC702795。该序列包含一个完整的ORF开放阅读框，长度为720bp，编码一个由239个氨基酸残基组成的多肽链，其核苷酸编码蛋白质理论分子量26.44kDa,等电点pi5.22。第二，茶树厂基因与杨树、葡萄这些木本植物的CAF基因聚在一起。表明它们同源性较高，具有较近的亲缘关系；与拟南芥的亲缘关系较远；与玉米、水稻等单子叶禾本科植物亲缘关系相对于拟南芥更远。另外,拟南芥中3个家族成设首先聚在~ -枝，说明厂物种之间的差异要大于家族成员之间的差异；为了研究不同植物的C5厂基因的序列特征，我们杨树、葡萄、拟南芥、玉米和水稻的蛋白质序列进行分析。结果显示：我们克隆到的茶树CAFJ基因编码的氮基酸序列和其他植物CBF转录因子一样，同样都含有AP2结构域；通过CyCAFJ的AP2结构域与其他植物的AP2结构域的隐马模型图，显示蛋甴保守区各位点的氨基酸保守性，可以推测出在这一结构域上每个氨基酸的最大可能频率。结果显示：AP2结构域高度保守，只有个别的序列发生变化。............