新城疫病毒对血管生长的抑制作用

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1、新城疫病毒对血管生长的抑制作用【摘要】目的研究鸡新城疫病毒对血管的生长抑制作用。方法采用小鼠肺癌转移模型观测鸡新城疫病毒（NDV）对癌细胞转移的影响及组织内微血管的生长情况；用体外药物敏感实验（MTT）检测NDV在不同剂量和作用时间下对人血管内皮细胞ECV304细胞的增殖抑制效应；用PI和Hoechst33342进行荧光染色检测NDV作用后细胞有无凋亡改变及其形态学变化。结果NDV在体内可以有效抑制小鼠发生癌转移时组织内微血管的生成，在体外可以抑制ECV304细胞的增殖并导致较为轻微的凋亡现象。结论体内外实验均表明NDV可以抑制肿瘤发生时微血管的生

2、长，这一作用通过抑制血管内皮细胞的增殖而非直接的细胞毒作用实现，该作用机制可能与某种特定病毒蛋白有关，尚待进一步研究。.L.编辑。【关键词】NDV；血管生成抑制剂；肺转移Groonarymetastasis肿瘤生长依赖从生长环境中获得营养并向环境排泄代谢产物，当肿瘤细胞的量较为少时，其与环境之间的物质交换可以通过弥散的方式来完成，但是，当肿瘤组织增大到一定程度时，物质交换就需要通过其间的血管网来完成。研究表明，肿瘤组织的增长速度与其对血液供应的依赖性成正比。因此，从理论上来说，通过抑制血管生长进而阻断肿瘤的血供，可以达到抑制肿瘤增长及转移的目的。大

3、量研究表明，鸡新城疫病毒可以通过直接的细胞毒作用和对肿瘤细胞凋亡的诱导作用起到抗肿瘤效果[1]。本研究通过体内、体外两种方法探讨了鸡新城疫病毒对血管生长的抑制作用，进一步揭示了鸡新城疫病毒抗肿瘤作用的机理。1材料和方法1.1实验材料新城疫病毒NDV（Lasoda株，冻干疫苗，华中农业大学动物医学学院）；昆明种小鼠，体重(20±1)g，由华中科技大学实验动物中心提供；细胞株：人脐静脉内皮细胞株ECV304由华中科技大学公共卫生学院赠送，小鼠S180细胞株由本实验室传代培养，均用含10%胎牛血清、100u/mL青霉素、100μg/mL链霉素的RPMI

4、1640培养基，在37℃5%CO2的培养箱中培养；试剂：RPMI1640培养基、胎牛血清、胰蛋白酶均为Gibco产品；四甲基偶氮盐（3[4，5dimethyl2thiazoly1]2,5diphenyltetrazoliumbromide）、Hoechest33342、碘化丙啶（PropidiumIodide）均为Sigma产品；HPIAS1000高清晰度彩色病理图文分析系统（清屏影像技术有限公司）1.2实验方法1.2.1病毒的复壮与收集将新城疫病毒Lasoda株活疫苗（NDVL）接种于9日龄鸡胚尿囊腔培养48～72h，收集尿

5、囊液，测得血凝效价为1∶640，分装于无菌离心管中，-20℃保存。1.2.2肺转移动物模型的建立取接种7天左右的种鼠，颈椎脱臼处死后抽取腹水，用生理盐水稀释至2.5×106/mL。经尾静脉注射接种瘤细胞，每鼠0.2mL[2]。1.2.3抗肿瘤转移实验将接种后的小鼠随机分为空白对照组及治疗组，每组10只。接种后24小时起腹腔给药（血凝效价1∶640，0.2mL/只），每3天给药一次，对照组给等量PH7.2的PBS，共给药5次。接种后第15天颈椎脱臼处死小鼠，解剖取肺并检查有无其他脏器及部位的转移。肺组织常规固定、包埋、切取最大截面计数转移灶数，并观察

6、肺组织内血管的生长情况。1.2.4MTT法检测NDV对人血管内皮细胞ECV304的作用取对数生长期细胞用含10%胎牛血清的RPMI1640培养基稀释为2×106/mL，接种于96孔板中，每孔100μL，之后依次加入用PH7.2的PBS10倍梯度稀释的NDV和阴性对照组，并保留仅加培养基的空白组。随后在37℃5%CO2的培养箱中连续培养24h、36h，然后每孔加入10μL5mg/mL的MTT溶液，连续培养4小时。吸去上清，每孔加入100μLDMSO，在570nm波长处用酶标仪测OD值。用下面的公式计算细胞增殖抑制率[3]：细胞增殖抑制率=OD空白-

7、OD样品OD空白×100%1.2.5荧光显微镜检测药物对ECV304细胞核形态学特征的影响分别将Hoechst33342和碘化丙啶（PI）配成100μg/mL的母液，用前等量混合。细胞经1∶4NDV处理16h、24h、48h后分组收集。每个标本取200μL移入EP管中，加入荧光染料Hoechst33342至终浓度10μg/mL，碘化丙啶（PI）20μg/mL，37℃下染色15min，取20μL细胞悬液迅速滴于载玻片上，加盖玻片，紫外光激发，在荧光显微镜下观察可见4种细胞形态，活细胞（VN）染为蓝色，核呈正常结构；早期凋亡细胞（VA）染为蓝色，核呈固

8、缩状或圆珠状；非凋亡的死亡细胞（NVN）染为红色，核呈正常结构；晚期凋亡细胞（NVA）也染为红色，但可见明显的染色质凝聚，