不同宫内缺氧时程对胎鼠神经干细胞增殖的影响及当归保护作用论文

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　　不同宫内缺氧时程对胎鼠神经干细胞增殖的影响及当归保护作用论文陈滟曹兵梅欣明曹坤余鸿【摘要】目的探讨不同宫内缺氧时程对胚胎大鼠神经干细胞增殖的影响及当归注射液的保护作用。方法将孕15d的SD大鼠随机分为9组：对照组、缺氧3h组、缺氧6h组、缺氧9h组、缺氧12h组、当归3h组、当归6h组、当归9h组和当归12h组，每组5只。所有当归组孕鼠经尾静脉注入当归注射液，然后用低张性缺氧模型致胎鼠宫内缺氧；所有缺氧组用生理盐水代替当归注射液，其余同当归组；对照组只注盐水，不缺氧。取胎鼠大脑组织，作Nestin免疫组织化学染色、图像分析。结果缺氧3h组、缺氧6h组和缺氧9h组阳性细胞较对照组染色增强，数量增多，缺氧12h组阳性细胞较对照组减少.freeleonproliferationofembryoneuralstemcells（NSE）andtheprotectiveeffectofAngelicainjection.MethodsThepregnantSDratsin15dayslydividedinto9groups:controlgroup(CG),hypoxia3hgroup(HG-3h),hypoxia6hgroup(HG-6h),hypoxia9hgroup(HG-9h),hypoxia12hgroup(HG-12 h),Angelicagroup3h(AG-3h),Angelicagroup6h(AG-6h),Angelicagroup9h(AG-9h),Angelicagroup12h(AG-12h).Everygrouphad5pregnantrats.ThepregnantratsinAngelicagroupsodelbryohypoxiainintrauterine.Inhypoxiagroups,0.9%normalsalineinjectionreplacedChineseangelicainjecta,easAngelicagroup.Thepregnantratsincontrolgroupalsaline,butaterials,thecerebrumofratembryomunohistochemicalstainingofNestin.ResultsInHG-3h,HG-6h,HG-9h,theimmunoreactivepositivecellsofNestinorethanthepositivecellsinCG.ButthepositivecellsinHG-12heasinAG-6handinAG-9h.Buttherehadnostatisticaldifferencebetetimeandconcentration(11%±1%)canstimulateembryoNSCintoproliferation,andthedegreeofproliferationisrelatedeofhypoxia.NSCachievedtheproliferationpeakathypoxia6handitsproliferationabilityehypoxiacancausereductionofNSC,ashypoxia12h.ChineseangelicahasacertainprotectivefunctionontheembryoratNSCofhypoxiainsometime,butlostthiseffectat hypoxia12h.Keycell;Hypoxia;Embryo;Proliferation;Angelica宫内缺氧可导致围产期胎儿严重的大脑损伤，是新生儿神经系统后遗症的常见原因，而神经干细胞（neuralstemcells，NSCs）的增殖、分化是神经系统损伤修复的关键步骤。目前有研究表明，一定程度缺氧可增强NSCs的增殖能力。Yang等［1］研究表明缺血缺氧能增强围产期大脑室下区神经干细胞的再生能力。该实验小组［2］在前期的研究中发现宫内缺氧1h可刺激神经干细胞增殖，但随着缺氧时间的延长将对NSCs产生怎样的影响目前尚未见报道。因此，研究不同缺氧时程对NSCs的影响，可为临床有宫内缺氧的胎儿的诊断、预后评价提供一定的理论依据。目前宫内缺氧在临床治疗上方法比较局限，疗效不确定。当归作为妇科要药已有数千年历史，现代医学研究发现当归具有解除血管平滑肌痉挛、促进新生血管的形成、抗氧化及抗衰老等作用。为此，本实验设计了当归对不同宫内缺氧时程胚胎大鼠神经干细胞的影响，以期探明当归对宫内缺氧胚胎大鼠神经干细胞的有效作用范围，用以指导临床治疗。 1材料云南系健康成年雌性等［3］发现缺血缺氧（10%O2）可促进SVZ和周围梗塞纹状体区NSC的增殖。余鸿等［2］发现宫内缺氧1h可刺激15d胎鼠大脑NSC表达Nestin增强，阳性细胞增多。Nestin既是NSC的标志物，其表达增强又与NSC的增殖密切相关。史冬梅等［4］在研究中发现，NSCs从核膜溶解到胞质分裂，其Nestin表达明显增多，尤以末期最高。因此，NSC表达Nestin的增强，说明其进入了分裂期，是细胞在增殖的表现。本实验中，宫内缺氧3，6，9h组胎鼠大脑NSC表达Nestin比对照组增强、阳性细胞增多，说明缺氧刺激胎鼠大脑中更多的NSC进入了增殖期,这可能是神经系统对缺氧刺激的一种保护性应激反应。然而，Romanko等［5］和Brazel等［6］则认为缺氧可以损伤SVZ区的神经祖细胞，诱导NSC凋亡。王煜等［7］人研究也发现体外缺氧培养条件下胚胎NSC凋亡增加。赵舒武等［8］以5%和10%的氧含量培养大鼠胚胎NSC，结果显示缺氧可抑制NSC的增殖，促进其凋亡，且与缺氧程度成正相关。本实验也发现宫内缺氧12h组胎鼠大脑NSC表达Nestin比对照组减弱、阳性细胞减少，说明宫内持续缺氧12 h可使NSC数量减少。综合分析缺氧引起NSC的增殖/凋亡的两种结论，可能是由于缺氧时间的不同、O2浓度的不同以及检测时间点的不同。因此，结合本实验研究结果，我们认为宫内缺氧（11%±1%）3～9h可刺激15d胚胎大鼠NSC的增殖，而缺氧达到12h时，NSC即表现为坏死或凋亡。这与孙崇毅等［9］的研究有一致性，他们在培养NSC的研究中发现，缺氧4h（强度适合）可以促进细胞的增殖；而长时间缺氧(12h)反而会抑制细胞的增殖。并且本实验还发现，在缺氧3，6，9h时虽然NSC都表现为增殖，但其增殖的情况不一样。NSC增殖在缺氧6h时达到高峰，在缺氧9h时其增殖能力已经开始下降。缺氧9h组Nestin阳性细胞较缺氧6h组数量减少，染色变浅。这说明缺氧对NSC的作用是一个动态过程，短时间缺氧（3，6，9h）会引起NSC增殖，长时间缺氧（12h或以上）会导致NSC凋亡；可能在缺氧6h时NSC的增殖达到高峰。当归为血中圣药，在方剂中的应用频率甚高。目前已证明，当归对心血管系统、造血系统、免疫系统、抗氧化和清除自由基等方面均有肯定的药理作用。本实验将当归应用于宫内缺氧，结果发现当归治疗3，6，9h组胎鼠大脑Nestin阳性细胞的IOD值较相应缺氧组胎鼠的减小。如前所述，缺氧3，6，9 h组胎鼠大脑NSC表达Nestin的细胞增多、染色增强是由于缺氧对NSC的刺激所致。虽然缺氧时NSC的增殖、分裂可能是神经系统对缺氧刺激的一种保护性应激反应，但是这种应激反应是由损害因素“缺氧”所致，而且这种增殖是超越正常发育状态的增殖。因此，如能减弱这种损害因素的影响，这种超常态的增殖必然减弱。所以缺氧3，6，9h的治疗组的Nestin阳性细胞减小，说明当归注射液减弱了缺氧刺激引起的NSCs的增殖，提示当归可以改善宫内缺氧状态，从而对宫内缺氧胎鼠有保护作用。这与熊杰等［10］报道当归有效成分丁基苯酞（NBP）可减弱缺氧刺激引起的NSC的增殖基本一致。但是，本实验结果也发现缺氧12h治疗组胎鼠大脑的Nestin阳性细胞的IOD值与相应缺氧组间无统计学差异，说明此时当归已失去保护作用。我们分析认为主要的原因有两个方面：一是由于缺氧的时程过长，导致细胞的坏死或凋亡；二是由于当归的有效作用时间（半衰期）已过，导致对后期的缺氧失去保护作用。综合各当归治疗组的结果，我们认为当归注射液对一定时限的宫内缺氧（3，6，9h）胎鼠神经干细胞有保护作用，而当归注射液对长时程的缺氧（12h）已失去保护作用。关于当归对缺氧的保护作用机制，根据已有的研究分析可能主要通过扩张血管、抑制子宫平滑肌收缩，从而改善胚胎大鼠的缺氧状态，并通过清除氧自由基，减少神经干细胞的钙超载，从而导致神经干细胞内Nestin合成减少，即减弱NSC的增殖。但在缺氧12 h时，NSC受损伤过重，细胞出现死亡，当归对其的保护作用消失。【