宫内急性缺血缺氧及再灌注对胎鼠肾脏环氧化酶系统的影响

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1、中国医科大学博士学位论文宫内急性缺血缺氧及再灌注对胎鼠肾脏环氧化酶系统的影响姓名：滕月娥申请学位级别：博士专业：儿科学指导教师：魏克伦2002.3.1簿士研究生论文富肉急性缺血缺氧及再灌注对胎鼠肾脏环氧化酶系统的影响博±垒：滕越娥(精生，jL专业)姆隳：魏爽伦中文摘要裁富嬲生jL燮怒楚澍燮』L豫亡翱伤残的主要病因之～。本病致贬致残的主要原鞠是窒怠缺氧造成多脏器(心、脑、肾簿)损伤所致。由于肾组织黪量淡耗大，磐巍流量多，使其成为对缺血缺氧最敏感的器宙。窒患爝肾损伤发生率藤，并且元特殊临床表瑰，早期诊断困难，往徒在肾损伤达严重程度才被发理，爨拢，对茭发病机

2、制的研究酾防治一直是儿斟医生嚣临的重要课题。薪垒』L窒息主要发生在蜜杰，约80～90％在产裁或产时。幽予宫内急性缺斑搏灌注模型的建立，嚣产期臀按馋发病枧铡的砑究已取褥了初步避爨。监已证实，炎癍发盛蹩缺血缺氧再灌注蟹按伤的重要发病机制之一。环氧纯酶(Cyclooxygenase，COX)是与炎嶷挺关豹酶，在人体毖有二种或型，COX一1先结构型；COX-2势诱导型。出予COX-2在生理状态下星低拷贝数表达，嚣褒缺氧、l器多糖、IL一1、TNF、表皮生长爨予翻趣小摄活化因子等许多炎瘗裁激医予终怒下大量诱生，因此，近年寒骞关COX-2谯缺盛缺氧褥灌注炎癍反应巾

3、捧鼹的瓣究邑城为人们瓣究的热基。大量研究显示：COX-2缀寄释基鬻表达在缺斑缺氧褥灌注后显著上调，徨是出于代谢产物盼不同，COX-2在不惑组织靛盎软袋秀灌注擐伤孛的馋超媳案艇不嗣。爨前为止，COX-2在缺盘苒灌注弩按揍孛的佟建并不十分清楚。它在富逡缺血缺氧褥灌注按佟后胎飘肾组织串表达的交纯，馨蠹外滏来见摄遂。PKC(Proteinkinasee)是ea2+／磷脂依赣性蛋蠢激薅，它在跨膜信号传导，缨胞博士研究生论文增臻分化及基因表达等方短都发挥着重要的调节作用。大羹臻究显示：PKC在缺虫缺氧要灌注肾损镌鼹被激活，并与COX-2基因表达密切榴关。基于以上原

4、觳，本研究以骀龄2I毽骀鬣淹研究对象，应用分子垒衔学方法检测富蠹缺盎缺氧及再灌注后胎甑肾组织COX的蛋自和基西表达，利爆放射免疫技术，测定胎肾缝织COX主要代谢产物PGE：，6-keto．PGF⋯TXB：水平的变化；采粥改楚的Takai法检测缺血褥灌注后瞥组织细胞内信号传导系统PKC活缝静变化，分析其与COX基因表达的关系，黻试图跌分子水平探讨COX系统在宫内缺矗缺氧及焉灌注瞥损伤发病梳镧串的作用，扶露为隧产甥肾损伤的预防稚治疗提供理论依据。材料与方法1．动物模型孕21秘SD大自甑腹腔麻醉后，下腹正中切口，暴鳐双角子宫及供应子宫释郛巢的动静脉鹿警，戳无

5、铷动脉夹锚夹一侧血管，对侧未钳夹宫角内的胎鼠为对慧缀(假手术维)。钳夹时闻为30分钟，达要求时间后取下动掰：夹行褥灌注，再灌注时阑分别为0分钟，30分钟，2小时，6小时，12小时，钳小酵，30小时。在PKC活性检测时，增加缺血15分钟，髯灌注i5分钟，荐灌注霹5分钟，再灌注1小时组。2．标本采集和处理模型一星满是条件后，立邵黼宫取飘，断头处死，取出完整船肾，按潋下方式分舅《保存：①标本置于10％中性福尔蜀林中圈定。②标本置予液氮中冻存。③标本置予一70‘E低温冰箱中保存。④无菌条件下取材，置予去RNA酶的Eppendorf管中，-80％冻存。3．实验方

6、法1)HE染色：固定后的组织常规脱水，包措，切片，行HE染色，在光学盈徽镜下观察肾缀绥形态学改变；2)放射免疫测定：将不同时间点的肾缀织分剐称重后匀浆，采用放射免疫法测定肾组织PGE：，及PGI：帮TXA2的稳定代谢产耪6-keto—PGF。。，TXB2的动态变化。3)免疫组织化学：利用COX氐COX-2特异性抗体，采用链菌素亲盎物·2·博士研究生论文素一过氧化藤免疫组纯方法(简称S-P法)检测肾缱织COX．1、COX-2表达及定位。4)Westernblotting：将肾缓织匀浆后，提取细胞貘蛋癌，利用COX一1、COX-2特异性抗体，耀Wester

7、n杂交检测不同时阉点COX．1、COX-2蛋自表达萤的变纯。5)RT-PCR半定量测定：用TRIZOL总RNA提取试剂提取瞥缀织RNA，反转录合成cDNA的第一铸，分瘸扩增COX．1、COX-2PCR产物，再经凝胶成像及分析系统扫描PCR产物，改13-actin为海参照标纯COX，1、COX-2量。6)PKC活性淄寇：将不同器于闻点肾缢织标本分别匀浆后，分离缁施膜蛋白和浆蛋白。阎位素C1，2p]标记ATP，用改懿的Takai法浏细施膜和细胞浆PKC活性。用酚试剂法测定蛋自浓度，计算院活髓。4．统计学分析：所褥数据箱均值士标准差(i±s)表示，统计分析采

8、耀Dtmnettt检验和q检验。结鬃1．缺血30分钟无荐灌注时，胎肾组苏学仅为肾涟肿表现，近益