早期干预对宫内感染致脑损伤仔鼠神经干细胞增殖能力的影响.doc

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早期干预对宫内感染致脑损伤仔鼠神经干细胞增殖能力的影响【摘要】目的研究早期干预对宫内感染致脑损伤新生大鼠内源性神经干细胞原位增殖能力的影响。方法30只孕17d大鼠连续2d腹腔注射脂多糖(450μg/kg)，设为脂多糖组,制备宫内感染脑损伤动物模型，生理盐水组6只注射等量生理盐水。将脂多糖组所产足月新生仔鼠用随机数字表法分为损伤组和训练组，生理盐水组所产仔鼠为对照组，每组各30只。对训练组进行早期干预至日龄28d,对照组、损伤组常规饲养;选取1，3，7，14，28d各组仔鼠用免疫组织化学方法动态检测海马齿状回颗粒层，BrdU阳性细胞的表达。结果(1)出生后1d对照组、训练组、损伤组新生大鼠海马齿状回颗粒层均存在BrdU，对照组显著高于训练组、损伤组(P<0.01)。(2)对照组BrdU阳性细胞数3d开始增加，7d达到高峰，14d后下降，28d接近正常成年大鼠水平。(3)早期丰富环境刺激后，训练组大鼠海马齿状回颗粒层BrdU阳性细胞数在3d开始增加，14d达高峰，峰值显著高于对照组水平(P<0.01)，28d后下降，但仍高于对照组，BrdU阳性细胞数在时间上均呈一过性增高表达。结论宫内感染致大鼠脑损伤可导致内源性神经干细胞增殖能力降低，并较长时间内难以自然恢复;早期干预可激活脑损伤鼠内源性神经干细胞原位增殖能力，推迟高峰出现，延长作用“时间窗”。【关键词】脑损伤;宫内感染;神经胶质增生;干预;大鼠;动物，实验　　【Abstract】ObjectiveTostudytheimpactofearlyinterventiononproliferationofneuralstemcellsinbraindamageratsafterintrauterineinfection.MethodsTotally36Wistarpregnantratswererandomlydividedintotwogroups:LPS(n=30)andsaline(n=6).PregnantratswereconsecutivelyinjectedwithLPS(450μg/kg)orsalineongestation17d.SalineneonatalratswererandomlyselectedassalinegroupN(n=30),LPSneonatalratastraininggroupT(n=30)andinjurygroupI(n=30).The1dTgroupratswereinterferedbyearlyinterventiont.Atthesametime,theN,Igroupratswerefedintheroutineway.Theexpressionofbromodeoxyuridind(BrdU)weredeterminedbyimmunohistochemistryat1，7，14，28dofallgroups.BrdUwasusedtomarkdividingneuralstemcells(NSCs)inhippocampdentategyrussubgranularzone(SGZ).Results(1)BrdUlabeledcellscouldbeobservedinallgroups;IgroupsandTgroupsweremarkedlylessthanNgroup(P<0.01).(2)ThenumberofpositivecellsofNgroupincreasedat3day(P<0.05),approximatelysixfoldwithapeakat7day,markedlydecreasedat28dayandapprochednormallevelofmaturerats.(3)ComparedwiththeNgroup,thenumberofpositivecellsofTgroupincreasedstrikinglyat3day(P<0.01),exceedingNgroupandapproximatelysixfoldwithapeakat14day,thengraduallydecreased,butstillhigherthanNgroupat28day.Theappearanceof6 increasingpeakinTgroupwaslengthened，valueascended.ConclusionsOurresultsindicatethatthebraindamagecausedbyintrauterineinfectioncanleadtothedecreaseofproliferationofinherentNSCs.Thedamagewillnotrecoveritself.EarlyinterventioncanstimulatetheproliferationofinherentNSCs.EarlyperiodenrichedenvironmentcanprolongthedevelopmentwindowphaseofinherentNSCs.　　【Keywords】Braindamage;Intrauterineinfection;Glialproliferation;Intervention;Rat;Animal，experiment　　神经干细胞(neuralstemcells,NSCs)在一定病理条件和干预作用下可以增殖、分化成神经元和神经胶质细胞，参与修复缺损的神经功能[1]。脑性瘫痪(简称脑瘫)是指出生前到出生后发育时期非进行性脑损伤所致综合征，是继小儿麻痹后儿童肢体严重残疾的主要疾病之一，孕期感染所致的脑损伤是脑瘫的高危因素[2]。因此,探讨宫内感染致脑损伤的发生机制，控制病情发展已经成为当前研究中的重点。本研究旨在观察早期干预对宫内感染致脑损伤后内源性NSCs的反应过程，为脑损伤后机体自我修复提供理论依据。　　1材料与方法　　1.1实验动物与试剂清洁级成熟Wistar大鼠60只，雌性40只，雄性20只，体质量180～240g，由佳木斯大学实验动物中心提供。脂多糖(脂多糖血清型055：B5，美国SIGMA公司)。5BrdU免疫组织化学试剂盒(北京博奥森生物工程有限公司)。　　1.2动物模型制备与分组运用李晓捷等[3]所建的宫内感染致脑损伤动物模型，将研究对象常规饲养,饮食自由,明暗周期12h/12h,室温(18±3)℃。于下午17时以2∶1合笼,次日上午8时查阴道涂片,查到精子记为妊娠0d,孕鼠另笼饲养。随机数字表法选取孕鼠分为脂多糖组30只和生理盐水组6只。脂多糖组孕17d大鼠连续2d腹腔注射脂多糖,剂量为每次450μg/kg;生理盐水组大鼠腹腔注射等量生理盐水。观察两组大鼠的分娩时间,孕22d前分娩的仔鼠为早产鼠,去除早产鼠。仔鼠出生后，取胎盘做苏木精伊红染色观察宫内感染情况。　　将脂多糖组所产足月新生仔鼠用随机数字表法分为损伤组、训练组，生理盐水组所产仔鼠为对照组，每组各30只。设生后1，3，7，14，28d5个时间点，每个时间点6只，测定BrdU水平变化，进一步分析探讨早期干预对脑损伤内源性NSCs增殖能力的影响机制。　　1.3早期干预方法　　1.3.1早期触摸在仔鼠出生后2～13d，每日将训练组仔鼠与母鼠分开1次，用毛刷从头至尾沿脊柱轻轻地摩擦，持续15min。　　1.3.2早期丰富环境6 早期触摸第7天始，给予训练组仔鼠丰富环境刺激，参照国内外文献设计[4，5]，在70cm×60cm×50cm的大笼内放置不同颜色、形状及气味的物体。包括各种质感的砂纸、毛刷，冰冷的金属和有刺激性气味的柠檬、薄荷棉球。还有转盘、管道、斜坡、秋千、跷跷板、小球等“玩具”，并配以舒缓的轻音乐。训练组仔鼠每日放入笼内4次，每次10min，每周将环境改变2次，以造成新异的刺激，总干预时间为21d。　　对照组和损伤组分别饲养于20cm×30cm×45cm标准笼内，不予早期干预。　　1.4BrdU标记和染色　　1.4.1BrdU标记BrdU溶于0.01%磷酸盐缓冲液，50mg/kg腹腔注射，共分2次，间隔6h。术后1d麻醉后处死。剥离头皮，沿前囟剪开颅骨，取出大脑，将其泡置于40g/L多聚甲醛(4℃)，固定，常规脱水，石蜡包埋，切片从视交叉冠状面到海马，片厚5μm，每5张取1张，每标本取10μm，行BrdU免疫组织化学染色。　　1.4.2BrdU免疫组织化学染色首先用50%甲酰胺和柠檬酸钠在65℃下处理脑组织切片2h，行DNA变性;3%过氧化氢，室温5～10min以灭活内源性酶;滴加正常山羊血清工作液，加小鼠抗BrdU单克隆抗体(1∶100倍)，室温，孵育2～3h;加生物化二抗(生物素化山羊抗兔IgG);加过辣根酶链霉卵白素工作液，室温孵育10～15min;磷酸盐缓冲液冲洗;联苯胺染色，苏木精复染。　　1.5BrdU免疫组织化学结果判定光镜(10×20)下以细胞核内有棕褐色或棕黄色颗粒且密度不均者为BrdU阳性细胞，观察阳性细胞在脑内分布情况;在显微镜400倍视野下计数阳性细胞,共计数5个视野,取其平均值。　　计算机图像分析系统软件(Imagemacro4.0)计数脑损伤后不同时间段海马齿状回颗粒层阳性细胞。　　1.6统计学方法实验数据以±s表示。采用SPSS13.0统计软件进行统计。两样本均数两两比较采用LSDt检验，多样本均数两两比较采用q检验。检验水准取α=0.05。　　2结果　　2.1各组BrdU阳性细胞数变化结果BrdU定位于细胞核，为棕色颗粒状，标记的是全部的新生细胞，训练组、损伤组、对照组大鼠海马齿状回颗粒层周边均存在BrdU阳性细胞，对照组出生1d大鼠的数量较多，排列较为规律，显著高于损伤组及训练组(P<0.01);损伤组及训练组BrdU阳性细胞数量稀少，无明显差异。见图1。　　2.2对照组BrdU阳性细胞数各时间点变化结果对照组BrdU阳性细胞数在出生3d开始增加，7d达到高峰，14d后下降，28d接近正常成年大鼠水平。见表1。6 　　2.3早期干预后各时间点各组BrdU阳性细胞数变化结果早期干预后，训练组大鼠海马齿状回颗粒层BrdU阳性细胞数在3d开始增加，14d达高峰，峰值显著高于对照组水平(P<0.01)，28d后下降，但仍高于对照组，BrdU阳性细胞数在时间上均呈一过性增高表达。见表1。　表1各时间点各组BrdU阳性细胞数变化注：与对照组比较，aP<0.05，bP<0.01;与训练组比较，cP<0.05，dP<0.01。　　3讨论　　近年来随着围产技术的迅猛发展,未成熟儿的成活率大大提高,早产、低出生体重儿致脑瘫呈上升趋势[6]。脑瘫的主要病理类型包括：脑室周围白质软化、脑室周围白质出血及梗死,以前者更为多见[2]，目前的研究亦着重于此。然而，虽然对可能导致脑瘫的脑损伤患儿采取了积极的干预处理，脑瘫的发生率仍然较高。　　NSCs具有自我更新，定向迁移，分化成神经元、神经胶质细胞的潜能，可参与修复缺损的神经功能。在发育和成熟的中枢神经系统中广泛存在着NSCs[7]，前脑室下带、海马齿状回颗粒层是最具代表性的区域。大部分NSCs在体内处于静止状态，损伤等病理条件可激发NSCs增殖，以弥补神经功能和组织学丧失，这显示NSCs可能在中枢神经系统损伤后自我修复中有潜在的治疗作用[8]。　　3.1宫内感染对新生大鼠BrdU阳性细胞的影响BrdU是一种胸腺嘧啶脱氧核苷类似物，在细胞增殖周期的S期嵌入细胞核的DNA，因而BrdU阳性细胞被看作具有增殖活性的细胞，是内源性NSCs增殖的标记物[9]。　　本实验发现，3组新生鼠在任何时间点海马齿状回颗粒层均存在BrdU阳性细胞，对照组BrdU阳性细胞在生后逐渐增多，2周左右达高峰，随后开始减少，到生后4周明显减少，呈现出胎龄越大，BrdU阳性细胞越少的趋势，这与文献[10]的研究结果相一致。损伤组及训练组在未干预前BrdU阳性细胞数目少于对照组，且损伤组各时间点BrdU阳性细胞数目均低于对照组，峰值低平。此结果与骆健明等[11]新生大鼠急性缺血缺氧性脑病模型内源性NSCs数目一过性上升不同，可能是由于本实验与前者急性损伤性质不同，宫内感染致脑损伤是仔鼠胎龄晚期受到的慢性损伤，脑内微环境的改变，各种起调控作用的神经营养因子的缺乏或改变引起调控干细胞分化功能障碍;脑发育过程中胶质细胞的发育障碍而导致“脚手架”引导功能的紊乱等原因，导致了NSCs和少突胶质细胞祖细胞受到破坏而数量不足。出生后，随未受损NSCs增殖发育，脱离不良的宫内环境及各种外界环境的刺激，仔鼠BrdU阳性细胞在一定程度和一定时间内上升，体现了新生脑神经系统可塑性。6 　　本实验结果与Levison等[12]幼鼠脑瘫模型结果相似，Levison等通过对新生鼠进行缺氧缺血的处理，形成幼鼠脑瘫模型，观察到脑瘫鼠脑组织中少突胶质细胞祖细胞及NSCs在一过性缺氧缺血后受到的影响是一个慢性的过程，NSCs数目减少，且在较长时间内难以自然恢复。由于NSCs与室周白质相关，破坏NSCs有可能导致室周白质再生困难，同时导致神经元的增生及分化障碍以及髓鞘的形成障碍，继而出现脑瘫[13]。这样可以解释产前因素和不明因素所导致的脑瘫患儿脑室周围白质软化及囊泡化的现象，继而出现永久性损伤并伴以特殊性的神经肌肉体征的原因。　　3.2早期干预对宫内感染致脑损伤仔鼠内源性NSCs影响早期干预是通过有组织有目的的丰富环境(视觉、触觉、嗅觉、味觉、听觉等各方面丰富的环境刺激)来减少发育期脑损伤及神经系统后遗症，促进脑损伤康复的一种手段。大量研究证明生后早期暴露于丰富环境，给予多感觉刺激可使运动皮质和视觉皮质树突长度增加及分支增多，并使脑组织代谢增强、脑血流变化及结构发生改变;脑瘫大鼠肌力、兴奋性、环境适应能力、记忆能力明显增强，达到正常化水平;平衡能力、协调能力、学习能力得到明显增强，可以显著改善脑瘫大鼠预后，降低伤残发生率[4]。　　早期干预促进宫内感染致脑损伤动物NSCs增殖的机制可能是通过改变脑内影响干细胞生存的微环境，如调节众多神经营养因子或激素的分泌等，从而进一步激活处于静止状态的干细胞[1]。众多研究已经表明，早期干预能刺激脑损伤大鼠的热休克蛋白70阳性神经元明显增加，热休克蛋白70是大脑对不良刺激的反应性蛋白，它可以保护脑梗死灶周边区(半暗带)的神经元，同时也保护了迁移至该区的NSCs，以防其受自由基、兴奋性氨基酸的损伤[5]。同时神经生长因子/营养因子，迁移相关蛋白如神经肽Y、神经营养因子3、脑源性神经营养因子、表皮细胞生长因子、胰岛素样生长因子1、神经生长因子受体(Trk)、reelin蛋白的合成也明显增强[14]。这些因子对干细胞增生、分化潜能的激发具有重要的作用。如往实验动物的纹状体、侧脑室等部位灌注外源性的生长因子能明显促进内源性NSCs的增殖、分化和迁移[15]。此外，早期干预还有促进降钙素基因相关肽、一氧化氮等血管舒张因子的合成和释放改善脑血管循环，减轻脑细胞缺氧，抑制伤灶局部炎症反应，改善大脑电生理活动等功效，这些条件的变化也会进一步影响NSCs的增殖分化[16]。Johansson等[17]的研究结果也证实了该观点，他们发现丰富环境可以促进脑缺血大鼠前脑室下带NSCs的增殖。本研究结果提示早期干预在降低宫内感染所致脑瘫神经组织再生方面有积极的作用，可能是脑损伤大鼠运动和学习能力恢复的重要机制之一，也为宫内感染所致新生儿脑损伤康复提供一种有效治疗手段。【参考文献】　　[1]SugayaK.Neuroreplacementtherapyandstemcellbiologyunderdiseaseconditions[J].CellMolLifeSci，2003，60(9)：18911902.　　[2]李树春.小儿脑性瘫痪[M].郑州：河南科学技术出版社，2000：13.　　[3]李晓捷,高晶,孙忠人.宫内感染致早产鼠脑瘫动物模型制备及其鉴定的实验研究[J].中国康复医学杂志,2004,19(12):885889.　　[4]李晓捷,吕智海,孙忠人.早期丰富环境刺激对脑瘫大鼠脑发育的影响[J].中国康复医学杂志,2006,21(12):10611064.　　[5]李玲,袁华,牟翔,等.康复训练对大鼠脑梗死后FOS和HSP70表达的影响[J].第四军医大学学报,2001,22(10):901904.6 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