氚水β射线宫内照射对仔鼠脑发育和学习记忆能力的影响

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氚水β射线宫内照射对仔鼠脑发育和学习记忆能力的影响?372?安徽医科大学ActaUniversitatisMedicinalisAnhui2006Aug;41(4)氚水13射线宫内照射对仔鼠脑发育和学习记忆能力的影响肖林林,陈光福,王明明,徐师国摘要目的探讨氚水B射线宫内照射对Wistar种大鼠脑发育和学习记忆能力的影响.方法用注射器将2rrIl蒸馏水或1—3ml不同浓度氚水经腹腔注入妊娠11d龄的母鼠体内,使得实验组母鼠体水氚放射性浓度在0—3.7GBq/L范围内.对宫内受照过的38d龄仔鼠进行条件饮水反应测试,实验结束脱颈椎处死仔鼠.开颅取出大脑,左半球脑组织进行常规组织化学分析,右半球脑组织用于脑内游离氨基酸含量的HPLC测定.结果随着母鼠体内注入氚水浓度的逐渐增加,其所产仔鼠大脑纵向长度,大脑皮层第V层锥体细胞数,海马CA3区细胞数及海马游离氨基酸含量逐步降低,相应地,仔鼠38—42d条件饮水测试成绩逐渐降低.且仔鼠大脑纵向长度缩短百分率,大脑皮层第V层锥体细胞数,海马CA3区细胞数减少百分率及海马游离羟脯氨酸含量增加百分率与仔鼠吸收剂量之间均可拟合成直线回归方程:Y=A+BlgD.结论在0.0038—1.9Gy吸收剂量范围内,宫内受照仔鼠学习记忆能力明显受损.主题词B射线/副作用;胚胎/辐射效应;脑/生长和发育;学习/辐射效应;记忆/辐射效应自由词氚水中图分类号R818;R14;R321.4;R338.64文献标识码A文章编号1000—1492(2006)04—0372—04 通过对日本原子弹爆炸受害者的辐射流行病调查…发现,人类胚胎在胎龄8—25周受辐照可导致小头畸形,严重智力障碍发生率增加,宫内受照者IQ值和在校成绩均低于正常儿童.ICRP49号出版物和UNSCEAR1986,1993年报告中有关辐射影响胚胎和胎儿脑发育的人类调查资料和动物实验资料表明,电离辐射能以损伤神经元前体细胞,影响神经元迁移及神经元间正确联系等多种方式干扰脑发育,使其结构异常,机能发育延迟和低下J.氚的排放是核电站及核燃料后处理厂影响环境的主要因素之一.氚水具有普通水一样的化学性质,可进人人体,对人体产生内照射.随着核电事业的发展,研究氚的辐射损伤效应,对保护工作人员和公众身体2006—03—16接收基金项目:安徽医科大学博士基金课题(编号:XJ2004001)作者单位:安徽医科大学核医学教研室,合肥230032作者介绍:肖林林,女,27岁,硕士研究生;王明明,男,4O岁,博士,副教授,硕士生导师,责任作者,E.mail:wmg~e@163.corn健康具有特别重要的意义.为此,我们开展氚水宫内照射来研究仔鼠脑发育和学习记忆能力的影响.1材料与方法1.1动物分组及照射处理采用Wistar种100—110d龄大鼠(购自安徽医科大学实验动物中心,普通级),随机分成4个实验组和1个对照组,每组4只,每只6鼠分别与1只同龄鼠合笼,每日清晨检查阴道涂片,发现精子定为妊娠第1天.实验组母鼠于妊娠第11天经腹腔注入1—3ml适当浓度的氚水,使4个实验组母鼠体水氚放射性浓度在7.4 MBq/L一3.7GBq/L范围内(见表1).对照组母鼠注入2ml蒸馏水,母鼠体水重按体重的62%计算.用美国PerkinElmer公司产Wallac一1409型液体闪烁测量仪测定母鼠和仔鼠尿氚放射性浓度,外标准道比法淬灭校正,计算出母鼠和仔鼠体水氚有效半减期.单次注入氚水,体水氚浓度平衡后随时间呈指数规律减小.设胎鼠组织含水100%,不考虑组织结合氚,则在注入氚水后t天时,胎鼠吸收剂量D胎(Gy)可按下式计算:D胎=6.9×10I.e..=1.0×10Iot(1一e..93)式中6.9×10为A,B,C,F,K的乘积:A为1Bq氚每天衰变数8.65×10;B为氚B射线平均能量5.7×10～Mev;C为每Mev相当的erg数1.6×10～;F为根据Gy定义引入的换算系数10～;K为胎鼠体水氚浓度与母鼠体水氚浓度的比值0.88;I.为注入氚水达到平衡时母鼠体水氚浓度;T为母鼠体水氚的有效半减期,取3.2d,t为从注入氚水至胎鼠出生的时间.仔鼠从出生后至43天龄的吸收剂量D仔可按下式计算:D仵=7.9×10fI0e..朋俯dt=1.1×10I'ot(1一e一.?∞仔)式中7.9×10～:A,B,C,F,K,意义同上;Io=I.Ke..嘲,为仔鼠出生时体水氚浓度;T仔为仔鼠体水氚有效半减期2d;为仔鼠出生后受体水氚照射时间.氚B射线给仔鼠造成的吸收剂量D包括仔鼠出生前受母鼠体水氚照射的吸收剂量D胎和胎鼠出生后受自身体水氚照射的吸收剂量D仔,即D=D胎 安徽医科大学ActaUniversitatisMedicinalisAnhui2006Aug;41(4)?373?+D仔[4..1.2方法1.2.1条件饮水反应行为测试行为训练在条件饮水箱内进行.选用6仔鼠于出生后第28天断乳,第34天断饮水,第35—37天每日在条件饮水箱内自由饮水15min,其余时间不给饮水;第38—42天进行5个实验日的行为训练,具体方法详见文献[5].1.2.2仔鼠大脑纵向长度测定及脑细胞计数仔鼠在行为训练结束后脱颈椎处死,开颅取出大脑组织,测量其纵向长度(大脑两半球中缝线上,以其前端和后端向两侧分开处两个起点间的距离CH.见图1.取大脑左半球脑组织,15%甲醛溶液固定72h以上,石蜡包埋,切片(厚5m,位置Ap一5.0一一5.3),常规HE染色.在显微镜(长春第一光学仪器厂产QCJ-2型测微目镜,×300)下随机计数5个视野内的大脑皮层第V层锥体细胞数,求出每平方毫米面积内平均细胞数;对海马,计数CA区细胞带上长500m,宽120m内的细胞数(未切到细胞核者不计),求得每平方毫米面积内平均细胞数.CH图1大脑半球长度测量图解1.2.3仔鼠海马游离氨基酸含量测定从大脑右半球分离海马组织,用日本日立公司638.50型HPLC仪测定氨基酸含量,反相梯度洗脱,丹酰氯柱前衍生,荧光检测,微机处理色谱图自动分析,方法详见文献[6]. 1.3统计学处理所得数据用SPSS11.0软件进行统计分析,以x±s表示.各指标除表6仔鼠条件饮水反射行为测试结果采用x检验,其它皆采用t检验.2结果2.1宫内受照仔鼠的吸收剂量仔鼠受母体子宫和自身体内氚水B射线照射所获得的吸收剂量值见表1.2.2大脑纵向长度由表2可知,各照射组仔鼠大脑纵向长度随剂量增大而缩短.0.019,0.19和1.9Gy各组仔鼠大脑的纵向长度均比对照组缩短.各照射组仔鼠大脑纵向长度缩短的百分率l,c(%)与D(Gy)的对数可拟合成直线回归方程:l,c=12.3+12.3lgD,与对照组相比,l,c=(对照组仔鼠大脑纵向长度一照射组仔鼠大脑纵向长度)/对照组仔鼠大脑纵向长度×100%,r=0.946,P<0.05.2.3脑细胞计数各组44只仔鼠大脑皮质第V层锥体细胞计数结果见表3.表143d龄仔鼠的吸收剂量表2各组仔鼠大脑纵向长度(x±s)与对照组比较:P<O.05,一P<O.Ol表3各组仔鼠大脑皮质第V层锥体细胞计数结果(x±s)与对照组比较:一P<0.01由表3可见,各照射组仔鼠大脑皮质锥体细胞数随剂量增加而减少,与对照相比,差异均有显着性;锥体细胞的缺失率l,N(%)随剂量增加而增大,在0.0038—1.9Gy的吸收剂量范围内,l,N(%)与D(Gy)的对数可拟合成直线回归方程:l,N=29.1+10.1lgD,与对照组相比,l,N=(对照组仔鼠锥体细 胞数一照射组仔鼠锥体细胞数)/对照组仔鼠锥体细胞数×100%,r=0.978,P<0.05.2.4海马细胞计数由表4可见,各照射组仔鼠海马CA区锥体细胞数随剂量增加而减少,与对照相比,差异均有显着性;锥体细胞的缺失率l,N(%)随?374?安徽医科大学ActaUniversitatisMedicinalisAnhui2006Aug;41(4)剂量增加而增大,在0.0038～1.9Gy的吸收剂量范围内,YN(%)与吸收剂D(Gy)的对数可拟合成直线回归方程:YN=23.1+18.6lgD,与对照组相比,yW=(对照组仔鼠锥体细胞数一照射组仔鼠锥体细胞数)/对照组仔鼠锥体细胞数×100%,r=0.976,P<0.05.2.5海马内游离氨基酸含量大多数种类的游离氨基酸含量,在各剂量组和对照组间差异无显着性.只有羟脯氨酸含量在各剂量组比对照组增加(见表5),且各组仔鼠海马游离羟脯氨酸含量呈剂量依赖性增加,受照仔鼠海马羟脯氨酸含量比对照的增加百分率Yn(%)与D(Gy)间也可拟合成直线回归方程:Yn=270.7+106.1lgD,与对照组相比,yH=(照射组平均含量一对照组平均含量)/对照组平均含量×100%,r=0.988,P<0.05.表4各组仔鼠海马CA3区锥体细胞计数结果(x±s)与对照组比较:P<0.05,一P<0.0l表5各组仔鼠海马内游离羟脯氨酸含量结果(x±s)与对照组比较:一P<0.0l2.6条件饮水反射行为测试结果表6表明,各组 仔鼠条件饮水反射行为的达标率随训练时间增加而逐步增大,第4天各组仔鼠达标率均达到最大值,且从第4～5天大鼠条件饮水测试成绩基本保持不变,同时,从第2天起观察到大鼠条件饮水测试成绩随受照剂量增大而下降的趋势.宫内受照大鼠第4天条件饮水测试成绩与对照大鼠的差异也随受照剂量增大而相应增大,且受照仔鼠第4天测试成绩与对照的差值Yc(%)与D(Gy)之间也可拟合成直线回归方程:Yc=68.2+48.4lgD,r=0.998,P<0.05.3讨论本实验结果表明,大鼠在孕期受氚水B射线内照射,各组仔鼠条件饮水反应的每日达标率均显着低于对照组.0.0038Gy剂量对动物的学习记忆行为已有损害,且损害程度与受照剂量相关;0.0038Gy以上各组仔鼠大脑纵向长度显着缩短,大脑皮层及海马锥体细胞数显着减少,海马内游离羟脯氨酸含量显着增加,且这些指标的改变与剂量的关系可表示为Y=A+BlgD的形式,符合以往所观察到的剂量效应关系类型'.研究证明,处于发育过程中的中枢神经系统,有较高的电离辐射敏感性,动物在子宫内受到0.1～1.0Gy剂量水平的照射时,可观察到明显的中枢神经系统损伤效应,甚至0.1Gy以下剂量照射时仍可观察到某些神经系统效应.较大剂量照射时,大量的细胞被杀死,结果足以产生可检查到的组织学变化,尽管可能存在其它机制,但细胞杀死在组织发病机理中被认为起决定作用.杨志远等..的研究表明,宫内受0.6Gy氚水照射使大鼠游泳机能发育不良率显着增加,大脑皮层神经元显 着减少;宫内受0.15Gy"Cs^y射线照射可使大鼠学习记忆能力及其大脑海马细胞数明显降低.海马是与学习记忆密切相关的脑结构,辐射对海马结构损伤必然影响到动物的学习记忆行为.有作者报道,胎龄8O～90d受到1.0Gy加Co^y射线的松鼠猴在视觉定位,分辨力及学习反应中的正确率显着降低,且其海马神经元细胞数显着减少.另外小鼠¨妊娠第18天或出生后第1天受1GyX表6各组仔鼠条件饮水反射行为测试结果组别剂量(Gy)n每天达标率38d15.0000042d各组第4天达标与对照差值对照l234l3ll96521.4 28.664.385.7与对照比较:一P<0.0l●●●O6373%H●●●O6473∞H●●●O54OO∞●●●O74OO8omo.安徽医科大学ActaUniversitatisMedicinalisAnhui2006Aug;41(4)?375?线照射导致其获取和运用空间信息能力欠缺.本实验结果表明宫内受照引起大鼠皮层及海马锥体细胞数减少可能损伤海马与其它脑区联系并影响其机能,从而损害相应的学习记忆行为.大脑皮层及海马锥体细胞减少和海马内游离氨基酸含量改变具有相同的剂量效应关系类型,提示辐射所致的细胞代谢改变与脑细胞数变化及相应的行为改变密切相关. 参考文献[1]PhilipJT,JohnRF.Theradioresponseofthecentralnervoussys-[2][3][4]tern:Adynamicprocess[J].RadiatRes,2000,153(4):357—7O.ICRP49号出版物[M].NewYork:PergamonPress,1986:14—28.UNSCEAR.Sourcesandeffectsofionizingradiation.UNSCEARReport1993[M]//AnnexH.RadiationEffectsontheDevelopingHumanBrain.NewYork:UnitedNations,1993.杨志远,郭月凤.出生前氚水照射致大鼠脑细胞缺失的剂量效应关系研究[J].辐射防护,1990,10(1):255—8.[5][6][7]郭月凤,王明明.不同孕期雄性大鼠受cs射线照射后仔鼠脑发育的影响[J].辐射研究与辐射工艺,2004,22(4):234—6.熊金莲,康宝珍.HPLC丹酰氯柱前衍生氨基酸分析系统在生物样品测定中的应用[J].中国辐射防护研究院年报,1991.杨志远,郭月凤,王明明.出生前"cs射线照射致大鼠脑发育障碍的剂量效应关系研究[J].辐射防护,1995,15(5):365—72.[8]ICRP60号出版物[M].NewYork:PergamonPress,1991:15—38.[9]杨志远,郭月凤.氚水单次注入妊娠大鼠对其仔鼠神经机能和 体重发育的影响[J].辐射防护,1987,7(6):434—6.[1O]郭月凤,杨志远,刘静雯,等出生前照射对大鼠学习记忆行为的影响及其机制探讨[J].辐射防护,1995,15(4):281—3.[11]OrdyJM,BrizzeeKR,DunlapWP,eta1.Effectsofprenatal6OCoirradiationontheneural,learningandhormonaldevelopmentofthesquirrelmonkey[J].RadRes,1982(2),89:309一l1.[12]SienkiewiczZJ,SaundersRD,ButlandBK,eta1.Prenatalirradi—ationandspatialmemoryinmice:Investigationofcriticalperiod[J].RadiatBiol,1992,62(2):2ll一9.EffectsofprenatalexposuretotritiatedwaterISraysinuterusonbraindevelopmentandlearningandmemoryofratoffspringsXiaoLinlin,ChenGuangfu,WangMingming,etal(DeptofNuclearMedicine,AnhuiMedicalUniversity,Hefei230032)AbstractObjectiveToinvesigatetheeffectsofprenatalexposuretotritiatedwaterBraysi'nuterusonbrainde-velopmentandlearningandmemoryoftheWistarratoffsprings.MethodsPregnantfemaleratsonthe11thdayweredividedintocontrolgroupandfourexperimentgroups.2mldistilledwateranddifferentconcentrationsoftriti-atedwater(HTO)wereperitoneallyinjectedintodifferentgroupsbysyringeandtheradiationconcentrationoftriti-uminwaterofthepregnantratbodiesinexperimentgroupsweremadeto0～3.7GBq/m1.Theconditionaldrink-ingbehaviourtestwasperformedontheoffspringsexposedtotritiatedwaterpraysinuterusonthe38thdayaftertheirbirth.Aftertestcompletion,theoffspringswereexecutedbycervicalvertebraedislocationandcerebraweretakenout,leftcerebralhemispheretissuewasanalyzedbyconventionalhistochemicaltechniqueandrightcerebral hemispheretissuewasusedtodeterminetheconcentrationoffreeaminoacidsbyHPLC.ResultsWiththein-creaseoftheconcentrationofHTOinjectedintopregnantfemaleratbodies,thecerebralportraitlength,thenumberofpyramidalcellsincerebralcortexVstratum,conecellsinCA3sectionofcerebralhippocampusandtheconcen-trationoffreehydroxyprolineincerebralhippocampusoftheoffspringsgradullydecreased.Therateofconditionaldrinkingresponsealsodecreasedstepbystep.Besides,therelationshipbetweentheabovefiveindexesandabosorbeddoseintheoffspringbodiesallfeaturedlinearregressionequation:Y:A+BlgD.ConclusionIntherangeof0.0038～1.9Gyabsobeddose,thelearningandmemoryabilityofoffspringsprenatallyexposedtoHTOBrayswassignificantlyimpaired,comparedwiththecontro1.MeSHbetarays/adverseeffects;embryo/radiationeffects;brain/growth/development;learn/radiationeffects'9memory/radiationeffects.FrlL,~wordtritiatedwater