人热休克蛋白72基因的克隆、原核表达与纯化论文

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1、人热休克蛋白72基因的克隆、原核表达与纯化论文.freels;cellline;heatshockprotein72;cloning;geneexpressionAbstract:AIMToclonehumanheatshockprotein72（HSP72）gene，doprokaryoticexpressionandpurifyHSP72proteinforfurtherstudy.METHODSHumanHSP72geneheatshockedhumanhepato-carcinomacelllineSMMC-7721.Itsprod

2、uctedtoE.colistrainJM109.Theproteins，expressedinE.colistrainidunderIPTGinduction，atographyandcharacterizedbySDS-PAGEandMC-7721经42℃热休克2h，于休克后16h［2］根据试剂盒说明提取细胞总RNA，反转录合成cDNA第一链，以其为模板PCR扩增HSP72目的片段.反应条件:去离子水37μL，cDNA1μL，引物各1μL，10×buffer5μL，25mmolL-1dNTP1μL，10mmolL-1MgCl23μL，混

3、匀，94℃变性5min，冰浴1min后，加入TaqDNA聚合酶1μL.PCR仪扩增，反应参数:先95℃预变性5min，然后按94℃1min，55℃1min，72℃2min的条件进行35个循环，最后72℃延伸10min.1.2.3HSP72基因的克隆与测序经PCR扩增后，扩增产物在10gL-1琼脂糖凝胶上电泳鉴定.将质粒pUC19和目的片段经EcoRI和PstI双酶切，回收载体和目的片段，在T4DNA连接酶作用下12℃过夜，连接产物转化大肠杆菌JM109，挑选阳性克隆，经质粒提取、酶切分析和PCR扩增鉴定后行全基因的全自动序列分析.1.2.4

4、HSP72基因的原核表达从经测序鉴定后的pUC19-HSP72中EcoRI和PstI双酶切回收HSP72目的基因片段，并与经同样限制酶双酶切的原核表达质粒pQE-30相连接，建立原核表达载体pQE-30HSP72，转化大肠杆菌JM109，挑选阳性克隆，经质粒提取、酶切鉴定后将含有表达载体的单一菌落在LB培养基（含100mgL-1氨苄青霉素）中过夜培养，然后转接至新的10gL-1LB肉汤管（含2gL-1葡萄糖、100mgL-1氨苄青霉素）中，继续培养至A值约为0.4～0.6，37℃加诱导剂IPTG至终浓度为1mmolL-1，取诱导0，0.5，

5、1，2，3和4h各组样品，SDS-PAGE检测表达产物，并用anti-HSP72单抗作109菌经培养和IPTG诱导表达后，12000g离心5min收集沉淀、经30mmolL-1NaHCO3（pH7.4）溶液4℃低渗30min，12000g离心15min取上清，PEG20000浓缩后过FPLC离子交换柱［4］，梯度洗脱，收集峰值蛋白液;浓缩后分别过SephacrylS200凝胶柱，收集峰值蛋白液;纯化蛋白液分别用SDS-PAGE检测相对分子质量，并用anti-HSP72单抗作探针，进行MC-7721扩增得到了长度约1.9kb的DNA片段（Fi

6、g1）.克隆基因的全自动序列分析结果与GeneBank所报道的人HSP72基因序列相一致.图1重组pQE-30HSP72载体DNA酶切后电泳图略2.2重组原核表达载体的构建与鉴定重组原核表达载体pQE-30HSP72转化大肠杆菌JM109后，经质粒提取和10gL-1琼脂糖凝胶电泳检测结果显示，用EcoRI酶切的A组，在5400bp处有一条带，经EcoRI和PstI双酶切的B组，在1900bp处和3500bp处各有一条带（Fig1）.2.3pQE┐30HSP72表达产物的检测重组pQE-30HSP72转化的大肠杆菌JM109，用IPTG诱导表

7、达后，经SDS-PAGE检测对照、实验组0h均无明显表达，实验组0.5，1，2，3和4h各组可见在Mr72000处有一蛋白带，随时间延长表达产物增多，2h时最多（Fig2）.用r72000处有一与anti-HSP72单抗结合带，随时间延长而加深.2.4纯化蛋白的鉴定经FPLC梯度洗脱和SephacrylS200凝胶过滤纯化的蛋白，经SDS-PAGE检测在Mr72000处有一条带，用anti-HSP72单抗行r72000处有一抗体结合带（Fig3）.图2－图3略3讨论HSP72是HSP70家族的主要成员，是热休克蛋白73（HSP73）的类似蛋

8、白，HSP73主要呈结构性表达于几乎所有细胞，而在哺乳动物中正常情况下很难测出HSP72，但在应激反应状态下HSP72会大量合成［5］.两者不仅相对分子质量相似，其结构、功能及生