人血浆非对称性二甲基精氨酸浓度的rp

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1、人血浆非对称性二甲基精氨酸浓度的RP【摘要】目的:建立一种测定人血浆中非对称性二甲基精氨酸（AsymmetricDimethylarginine，ADMA）浓度的反相高效液相色谱法（RP-HPLC）。方法:采用A在0.05～5μg/ml范围内有良好线性关系，最小检出量为0.05μg/ml，平均相对回收率为（93.76±2.57）%，日内、日间平均变异系数分别为(3.25±1.59)%、(4.60±1.37)%。结论:本方法准确、简便、快速，适用于科学研究和临床检测。【关键词】非对称性二甲基精氨酸色谱法反相高效液相血浆中非对称性二甲基精氨酸(Asymm

2、etricaldimethylarginine，ADMA)浓度变化与心血管疾病发生发展密切相关，近年来研究显示ADMA升高是一种新的心血管病危险因素[1]。关于血浆中ADMA浓度的检测方法，国外虽已有报道[2，3]，但操作繁琐，干扰因素多。国内曾有采用正相色谱法的报道[4]。本研究在国内外同类研究的基础上适当改进，采用反相色谱法，用一元线性梯度洗脱，建立一套准确、简便、快速的高效液相色谱法检测人血浆中ADMA浓度的方法，报告如下。1材料1.1试剂AMDA标准品、衍生剂OPA、3-巯基丙酸均购自Sigma公司，HPLC分析纯度>99.99%；甲醇

3、为一级色谱纯，购自天津市四友生物医药科技有限公司；硼酸为一级色谱纯，购自上海试剂总厂；乙酸钠、冰乙酸、氢氧化钾、5-磺基水杨酸为分析纯，购自上海试剂总厂。超纯水（18.25MΩ·cm）。1.2仪器与设备高效液相色谱仪为Agilent1100系列，包括G1322在线脱气机、G1311A四元泵、G1316A柱温箱、G1321AFLD荧光检测器；自动进样器；Agilent化学工作站（RevA.08.03.[847]）。高速离心机（TGL-16G，上海安亭科学仪器厂出品）；漩涡混合器（XDA工作液配制准确称取ADMA标准品10mg于100ml容量瓶中，用超纯

4、水溶解并定容，得浓度为100μg/mlADMA储备液。再用超纯水依次稀释为1μg/ml、2μg/ml、4μg/ml、8μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、40μg/ml的ADMA工作液，贮存于4℃备用。1.4流动相A配制精密称取乙酸钠4.1g，用重蒸水溶解后，在1000ml容量瓶中定容，用2mol/L冰乙酸调节pH值到6.8，即得浓度为0.05μmol/L，pH6.8的乙酸钠溶液，然后用0.45μm滤膜过滤，超声脱气。1.5OPA衍生剂配制精确称取OPA20mg，加400μl的甲醇，0.2mol/L硼酸3.6ml（pH=9.5），3-巯基丙酸

5、20μl，混匀避光（现配，现用）。2方法和结果2.1色谱条件色谱柱：metryC18柱（5μm，3.9mm×150mm），保护柱：metryC18保护柱（5μm，3.9mm×20mm）；流动相：A为0.05μmmol/L乙酸钠（pH6.8），B为甲醇，按B14%15min，31%25min，45%5min（V/V/V）梯度洗脱；进样量20μl；流速1.0ml/min；柱温40℃；荧光检测波长：激发波长330nm，发射波长450nm。2.2血浆样品处理方法于1.5ml离心管（EP管）中精密加入待测血浆1.0ml，加入20mg5-磺基水杨酸，漩涡混匀5m

6、in，冰浴15min，于12000r/min离心10min，吸取上清液。2.3样本柱前衍生取“2.1”中上清液100μl，加OPA衍生剂100μl，漩涡混匀避光2min后，上机，自动进样检测，色谱图见图1，可见血浆中ADMA峰形良好，分离完全，无杂质峰干扰。.L.编辑。2.4标准曲线的制备于7支1.5ml离心管中依次加入不同量的不同浓度的AMDA工作液，再各加入人空白血浆，配成终浓度依次为0.05μg/ml、0.1μg/ml、0.2μg/ml、0.5μg/ml、1.0μg/ml、2.0μg/ml、5.0μg/ml的血浆标准品溶液系列。再按血浆样本处理

7、方法处理后分别测定，并记录色谱图，以峰面积为纵坐标，ADMA浓度为横坐标进行线性回归，得直线回归方程Area=60.90027848×Amt+3.5852958，r=0.99973，最小检出量0.05μg/ml，其含量在0.05～5.0μg/ml之间有良好的线性关系。2.5精密度试验按“2.3”项分别配制浓度为0.1μg/ml、0.2μg/ml、0.5μg/ml的血浆标准品溶液。按血浆样本处理方法处理后，日内衍生5次，隔日再衍生5次，分别计算日内变异和日间变异。结果见表1。2.6回收率试验（相对回收率）按“2.3”项分别配制浓度为0.1μg/ml、0

8、.2μg/ml、0.5μg/ml的血浆标准品溶液。再按血浆样本处理方法处理后测其浓度，以实测浓度与配制浓度之