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时间:2018-11-16
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1、核转录因子KLF6在非酒精性脂肪性肝纤维化形成中的作用【摘要】目的研究大鼠非酒精性脂肪性肝纤维化形成过程中,肝脏核转录因子KLF6及相关基因表达变化及其作用。方法建立高脂饮食脂肪性肝纤维化模型,用RTPCR与免疫组织化学法观察肝组织中KLF6、TGFβ1、αSMA表达变化,放射免疫法检测血清肝纤维化指标HA、LN、CⅣ。结果模型组大鼠高脂喂养8周呈现单纯性脂肪变,肝脏KLF6、TGFβ1、αSMA的mRNA表达与正常对照组相比差异无统计学意义(P>0.05)。12周时随着脂肪变的加重,KLF6mRNA表达上调(0.62±0.10,
2、P<0.01),于16周达高峰(1.01±0.07,P<0.01),24周略有回落(0.81±0.08,P<0.01);而TGFβ1和αSMA的mRNA表达于16周时开始增高(0.62±0.19、0.77±0.12,P<0.01),24周达高峰(0.91±0.07、1.08±0.19,P<0.01)。相关分析发现,KLF6与TGFβ1、αSMA表达以及肝纤维化分级评分之间呈显著正相关(r=0.848、0.859、0.706,P<0.01)。结论高脂饮食引起KLF6表达增强,最初可能是一种适应性反应,随着
3、其表达进一步增强,可引起TGFβ1和αSMA表达持续上调,从而促进脂肪性肝纤维化的发生、发展。【关键词】KLF6转化生长因子β1平滑肌肌动蛋白非酒精性脂肪性肝病肝纤维化【Abstract】ObjectiveTostudytheexpressionandsignificanceofKruppellikefactor6(KLF6)andrelativegenesduringthecourseofdevelopmentofnonalcoholicfattyliverfibrosisinrats.MethodsAratfattyliverfibro
4、sismodelinggromunohistochemistryandRTPCR.Inthemeantime,HA,LNandCIVeansofradioimmunity.ResultsAtthe8thRNAparedRNARNAbegantoupregulateto(0.62±0.19,0.77±0.12)atthe16thotedevelopmentoffattyfibrosis.【Keyinggrooothmucleactin;Nonalcoholicfattyliverdisease;Liverfibrosis肝纤维化是肝脏对各种慢
5、性损伤疾病的一种修复应答反应,具有可逆性。细胞因子网络调控的肝星状细胞(hepaticstellatecell,HSC)活化是肝纤维化形成的主要发病机制。体内外实验证明在HSC的活化过程中相关细胞/生长因子的转录均受相应的核转录因子的调控。已知在肝纤维化发生过程中转化生长因子β1(transforminggroa公司;KLF6兔多克隆抗体购自Satan公司;平滑肌肌动蛋白(αsmoothmucleactin,αSMA)小鼠单克隆抗体购自武汉博士德。1.2方法1.2.1动物模型[2]雄性asson染色观察有无肝纤维化并分级,依据纤维化的范围和程
6、度将脂肪性肝纤维化分为5级,S0:无纤维化;S1:腺泡带局灶性或广泛的窦周/细胞周纤维化;S2:纤维化扩展到门管区星芒状纤维化;S3:纤维化扩展到门管区周围,局灶性或广泛的的桥接纤维化;S4:肝硬化。肝纤维化分级评分标准:S00分;S11分;S22分;S33分;S44分。1.2.4免疫组化肝组织石蜡切片常规脱蜡至水,3%过氧化氢阻断内源性过氧化物酶,PBS洗3次,pH8.0EDTA微波修复,滴加不同稀释浓度的一抗(KLF61∶200,αSMA1∶50)后4℃过夜,次日滴加二抗,37℃孵育1h后DAB显色,经苏木素复染,稀盐酸酒精分色后封片观察,
7、每次实验均设阴性对照,以磷酸盐缓冲液代替一抗。每例均随机观察5个高倍视野,读取阳性细胞数。王晓敏,等.核转录因子KLF6在非酒精性脂肪性肝纤维化形成中的作用1.2.5KLF6、TGFβ1、αSMAmRNA检测肝组织总RNA的提取,按Tripure试剂盒说明进行操作,最后加入DEPC去离子水20μl重新溶解RAN,待用。RNA样品的纯度根据260nm及280nm吸光值的比值(A260/280)来计算,比值在1.6~2.0之间。RNA样品的电泳鉴定:取用1%甲醛变性琼脂糖凝胶,10μgRAN样品电泳,紫外观察,如28S、18S、5SrRAN带清晰
8、可见,带与带之间无明显脱尾则表明RAN无明显降解,可用于RTPCR分析。1.2.6引物设计利用引物设计软件设计各引物。KLF6上游引物
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