携氧剂对有效霉素a生物合成影响及机制探索

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1、携氧剂对有效霉素A生物合成影响及机制探索第一章研究背景综述1.1有效霉素的发现与组分有效霉素最初是日本科学家在筛选抗纹枯病病原菌菌丝的过程中从吸水链霉菌梓檬变种hygroscopicusvar.limoneusT-7545)中获得的抗水稻纹枯病次级代谢产物，经过分离纯化，在明确了其主要成分后命名为有效霉素，并进一步明确了抗生素生产环境等特点⑴。而我国也在1973年，由上海农药所在井问山地区简选到一株吸水链霉菌亚种，该菌株分泌的一种次级代谢产物具有类似于有效霉素的抗真菌效应。其化学成分与组成结构经鉴定与有效霉素相同。本研究所使用的吸水链霉菌yceshygroscopicusvanjingga

2、nggensis便是上海农药所报道的吸水链霉菌井网变种。对有效霉素各组分结构进行的研究发现，有效霉素并非单一结构。目前已发现存在有效霉素A、B、C、D、E、F、G和H等八种不同结构的同系物这些同系物都是具有相同骨架结构的衍生物，其全部组成的80%是由A,B组分构成。其中A组分具有最强的抗菌活性也是被用作生物农药的主要成分(图1-1)。因此本课题将其列为研究的目的代谢产物。1.2有效霉素A的抗菌机理及应用1.2.1有效霉素A的抗菌机理在有效霉素A发现之后，科学家对其抗菌机理进行了大量研究。有效霉素A被发现可以迅速的枯附到枯纹病菌菌丝体上并被菌体吸收，并通过对菌体生长进行干扰与抑制，从而起到防

3、治作用。Tris-HCL(pH8.0)2.5ml；0.5MEDTA0.5ml；5MNad5ml；去离子水定容到250ml。(3)考马斯亮蓝G250染色液：称取50mg考马斯亮蓝G250溶于95%(v/v)的乙醇，加入50inl的碟酸(含量285%),用去离子水定容到500ml，滤纸过滤，存放于棕色瓶，室温放置。(4)液相碟酸盐缓冲液：吸取7.8g/L的NaH2PCV2H20溶液51ml，吸取17.9g/L的Na2HPCV12H20溶液49ml，用去离子水定容到1000ml，调节pH到7.0。(5)养基：产抱平板培养基(SFM):黄豆饼粉20g(煮透，过滤去沉淀)；甘露醇20g;琼脂20g;

4、去离子水1000ml;pH自然。12rC灭菌15分钟。种子培养基：玉米粉30g以及黄豆饼粉22g煮透，过滤去沉淀)；酵母提取物l0g;氯化纳2g;祷酸二氢4f0.8g;去离子水1000ml;pH自然。121°C灭菌15分钟。发酵培养基：玉米粉100g;黄豆饼粉25g;酵母提取物5g;氯化纳Ig;碟酸二氧钟1.5g;去离子水1000ml;pH自然。12rC灭菌15分钟。(6)菌种活化与收集保藏将悬浮于冻藏甘油管中的抱子液常温融化，用接种环沾取抱子液在灭菌后的SFM平板培养基上划线接种。接种后将培养基置于37°C培养箱中培养，经过5-6天培养，观察到培养基表面气生菌丝有青色拖子

5、长出时，在平板中加入8ml25%甘油并用接种环将拖子刮下，用移液器将孢子悬浮液吸到离心管中，置于-20°C保存，用于菌种的活化以及发酵接种。第三章液体石蜡对发酵过程中活性氧物质产生.........203.1材料与仪器.........203.1.1菌体与发酵条件.........203.1.2主要试剂.........23.1.3溶液配制.........213.1.4主要仪器.........213.2实验方法.........223.3实验结果.........25第四章液体石蜡对代谢基因表达的影响.........294.1材料与仪器.........294.1.1菌体与发

6、酵条件.........294.1.2主要试剂.........294.1.3溶液配制.........294.1.4主要仪器.........304.2实验方法.........304.3实验结果与讨论.........344.3.1次级代谢调控基因的表迖水平.........344.3.2有效霉素A结构及其合成相关基因的表达水平.........35第五章液体石蜡对代谢途径中相关酶的活性影响.........385.1材料与仪器.........385.2实验方法.........405.3实验结果与分析.........425.4总结与讨论.........44第八章其他影响因子的作

7、用探索作为抗生素合成的前体物质，氧基酸可以直接参与到抗生素合成途径中参与合成反应；氨基酸或其功能肽结构可以作为抗生素合成过程的激活剂或抑制剂对代谢途径中关键醇的活力进行调节；作为氮源，培养基中氛基酸的种类与含量也会影响菌体的生长速率；而作为两性小分子，氨基酸的水解产物会造成培养基中pH波动，改变微生物的生长环境。在发酵过程中添加氣基酸促进发酵产量的方法巳在很多微生物中进行了应用[83_86]。Cheng等[87]发现在培