冷藏酱鸭中乳酸菌的分离鉴定及生物学特性研究

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1、冷藏酱鸭中乳酸菌的分离鉴定及生物学特性研究陈娟娟１，周延清１，李静云１，张喻１，王婉珅１，范玉霞１，常钊１，岳晓杰１，苑璐璐２（１．河南师范大学生命科学学院，河南新乡４５３００７；２．周口市科技局，河南周口４６６０００）摘要：从冷藏的酱鸭中分离筛选乳酸菌，对其进行生理生化特性研究和分子学鉴定。结果表明，从冷藏酱鸭中筛选到２株优良乳酸菌，分别命名为Ｊ１、Ｊ２。结合细菌形态学、生理生化特性和１６ＳｒＤＮＡ序列同源性以及系统进化树分析表明Ｊ１、Ｊ２为副干酪乳杆菌亚种（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｐａｒａｃａｓｅｉｓｕｂｓｐ．），具有比较好的发酵产酸的能力

2、，并且对大肠杆菌（Ｅscherichiaｃｏｌｉ）和金黄色葡萄球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ）具有很强的抑制作用，能够耐受极端的ｐＨ环境。关键字：酱鸭；乳酸菌；分离；鉴定中图分类号：Ｑ９３９．１１+７文献标识码：A：0439－８114（２０15）03－0６７６-0４乳酸菌是一种常见的益生菌，具有直接为宿主提供营养物质、促进人和动物生长、调节胃肠道及泌尿生殖道的正常菌群、增强机体免疫和维持微生态平衡等多种功能［１］，被广泛应用到医学、食品、饲料工业和环保等方面。乳酸菌在自然界分布广泛，从人体及动物的肠道，到植物、发酵食物、饮料乃至土

3、壤中都存在乳酸菌。曾经有研究者报道过从肠道内容物［２］，发酵的乳制品［３，４］，腌制的泡菜［５，６］，冷藏的鲜肉［７］，发酵的肉制品［８］中分离出各种优质乳酸菌。肉类中，鸭是一种常见的加工原材料，可以直接或发酵后制成板鸭、卤鸭、酱鸭、虾油鸭等［９，１０］，每一种做法都会赋予其特殊的风味。乳酸菌在发酵的过程中可以产生乙醛和双乙酰等风味物质，从而使发酵制品具有特殊的风味，而发酵的鸭类可能是因为乳酸菌产生了一些风味物质，使其有了独特的风味。林巧［９］从发酵的建昌板鸭中分离到了１７株菌株，通过形态学和生理生化特征进行了鉴定，并从中筛选出了一株耐盐的适合发

4、酵板鸭的菌株。本研究旨在从冷藏的酱鸭中分离乳酸菌，通过形态学、生理生化特征和基因学进行鉴定，再通过发酵产酸试验、低ｐＨ耐受试验、抑菌试验等进一步研究其特性。１材料与方法１．１材料１．１．１样品的采集从河南省新乡市温州酱鸭店购买一只酱鸭，放于无菌的袋子里并放进冰盒内，带回实验室于４℃冰箱冷藏保存。１．１．２培养基ＭＲＳ培养基，明胶液化培养基，葡萄糖产酸培养基，葡萄糖酸盐产酸培养基，脱脂奶粉培养基，按文献［１１］的方法配制。１．２方法１．２．１乳酸菌的分离及筛选将放在４℃冰箱２周的酱鸭取出，用无菌解剖剪取１ｇ，并且充分剪碎，加入９ｍＬ无菌生理盐水中，

5、充分摇匀，然后依次稀释到１０－４、１０－５、１０－６，分别吸取１００μＬ接种在含１．５％的ＣａＣＯ３的ＭＲＳ平板培养基上，３７℃恒温培养箱内培养４８ｈ。挑取具有透明圈的单菌落划线纯化，连续纯化３次，４℃冰箱保存备用。１．２．２乳酸菌的生理生化鉴定参照文献［１１］，通过革兰氏染色、接触酶反应、运动性试验、明胶液化试验、葡萄糖和葡萄糖酸盐产酸产气试验、甘油发酵试验、Ｄ－山梨醇发酵试验、淀粉发酵试验、蔗糖发酵试验等对分离到的乳酸菌进行初步的鉴定［１１］。１．２．３乳酸菌的分子鉴定将活化好的菌株利用ＣＴＡＢ的方法提取菌株的总ＤＮＡ，以基因组ＤＮＡ为模版扩

6、增１６ＳrRＮＡ。引物是用Ｃｈａｏ等［１２］报道过的引物，２７Ｆ：ＡＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣＣＴＧＧＣＴＣＡＧ和１５４１Ｒ：ＡＡＧＧＡＧＧＴＧＡＴＣＣＡＧＣＣＧＣＡ扩增其１６ＳｒRＮＡ，引物由华大生物有限公司合成。ＰＣＲ反应体系为２５μＬ，其中１０×ＥａｓｙＴａｑＢｕｆｆｅｒ２．５μＬ，ｄＮＴＰｓ２．５μＬ，ＥａｓｙＴａｑ０．２５μＬ，模版ＤＮＡ１μＬ，上游引物１μＬ，下游引物１μＬ，无菌去离子水１６．７５μＬ。反应条件：９４℃３ｍｉｎ预变性；９４℃３０ｓ，５５℃３０ｓ，７２℃１ｍｉｎ，进行３５个循环；最后７２℃延伸１０ｍｉｎ；４℃保存。用１％的琼脂

7、糖凝胶电泳检测，切胶回收１５００ｂｐ左右的片段，用生工生物工程（上海）有限公司的胶回收试剂盒回收，回收产物送到生工生物工程（上海）有限公司进行测序，测序结果在ＮＣＢＩＧｅｎＢａｎｋ数据库中进行同源性比较，并且用ＭＥＧＡ５．０５建系统进化树做进一步的分析。１．２．４乳酸菌产酸能力的测定乳酸菌发酵产酸的能力是作为发酵酸奶的优良菌株筛选的重要指标。酸奶的酸度一般以中和100ｍＬ牛乳所需的０．１ｍｏｌ／Ｌ氢氧化钠的毫升数来表示，称为°Ｔ，此为滴定酸度简称为酸度。将待测菌株接种于ＭＲＳ培养液，３７℃恒温培养过夜，活化３代，以充分活化实验菌株。将活化好的菌株

8、按３％的接种量接种于装有１０％脱脂乳培养基的试管中，３７℃恒温培养至凝乳，记录凝乳时间。凝乳后置于４℃冰箱中后熟２４ｈ，测定每个管的ｐＨ